スクリーニング

专利摘要:
ＧＰＣＲの立体構造特異的結合パートナーを生産する方法であって、 ａ）親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造で増大した安定性を有する、該親ＧＰＣＲのＧＰＣＲ変異体を提供する工程、 ｂ）試験化合物を提供する工程、 ｃ）前記試験化合物が、特定の立体構造を備える場合の前記ＧＰＣＲ変異体に結合するか否かを測定する工程、及び ｄ）前記特定の立体構造を備える場合の前記ＧＰＣＲ変異体に結合する試験化合物を単離する工程を含む方法。親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲを生産する方法も開示される。
公开号:JP2011508875A
申请号:JP2010538902
申请日:2008-12-19
公开日:2011-03-17
发明作者:マルカム；ピーター ウィア，；フィオナ；ハミルトン マーシャル，
申请人:ヘプテアズ セラピューティクス リミテッドＨｅｐｔａｒｅｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ；
IPC主号:G01N33-50

专利说明:

[0001] 本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の結合パートナーのスクリーニング、特にＧＰＣＲの立体構造特異的な結合パートナーに関する。]
背景技術

[0002] 本明細書に記載の明らかに過去に公開された文献の記載又は議論は、必ずしも、その文献が従来技術の一部であるか又は一般的な技術常識であると認めるものと解されるべきではない。]
[0003] ＧＰＣＲは、多数の生理プロセスを調節する非常に大きなタンパク質ファミリーを構成し、多数の効果的な薬剤の標的である。かくして、それらは、非常に薬理学的に重要なものである。ＧＰＣＲの一覧は、参照によって本明細書に取り込むFoord et al (2005) Pharmacol Rev. 57, 279-288に挙げられている。ＧＰＣＲは一般的には単離した際に不安定であり、多大の努力が為されたにもかかわらず、例外的に天然に安定であるウシロドプシン、及び融合タンパク質として又は抗体断片との複合体として結晶化されたβ２アドレナリン受容体だけが結晶化可能であった。]
[0004] ＧＰＣＲは新薬の開発につながるような標的であり、現在の薬剤の四分の一超がＧＰＣＲを標的とすることを示すOverington et al (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996 が特に参照される。]
[0005] ＧＰＣＲは、アゴニスト及びアンタゴニストなどの各種の薬理学的な種類のリガンドと結合する多数の異なる立体構造で存在し、機能するためにこれらの立体構造の間で循環すると解されている（Kenakin T. (1997) Ann N Y Acad Sci 812, 116-125）。立体構造の間での切り替えが受容体の結晶構造を得ることの困難さに寄与する。]
[0006] ＧＰＣＲに対する立体構造特異的結合パートナーの作製はいくつかの因子によって妨げられる。例えば、ＧＰＣＲは一般的にそれらの天然の膜環境から切り離した際に乏しい安定性を有し、それらが即時に変性又は沈殿せずに試験することが可能な条件の範囲を厳しく制限する。精製ＧＰＣＲをそれらの天然立体構造で生産できないことは、精製受容体の使用に依存する広い範囲のスクリーニングパラダイムにおけるそれらの使用を妨げる。故に、ＧＰＣＲスクリーニングは伝統的に、受容体が細胞膜又は全細胞中に存在するアッセイに依存してきた。]
[0007] 多くのＧＰＣＲは、抗体などのバイオセラピューティックによって利用され得る重要な治療標的である。ＧＰＣＲに対する治療用抗体の作製は、一部には適切な免疫原の欠如の故に極めて困難であった。通常の経路は、受容体の小さなペプチド断片を免疫のために採取することであるが、これらはその天然の立体構造を保持せず、多くの場合に、受容体に結合して受容体を標識することは可能であるが、機能的なアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有さない、結合パートナーを生じさせる。ＧＰＣＲの特有の物理的立体構造の故に、抗体などのバイオセラピューティックは、ペプチド断片が単離において使用された際に失われる特徴である、ポリペプチド「ループ」の組み合わせを認識することも知られている。ＧＰＣＲの局所的な膜環境がタンパク質の三次構造を維持し、いずれのエピトープが細胞外表面に存在するかを支配することはよく知られている。これらのエピトープは、理論的にはバイオセラピューティックによって認識されることが可能であるが、標的ＧＰＣＲを含む膜又は膜断片に対する抗体などのバイオセラピューティックを産生することは簡単ではなく、というのはこれらの製剤は不可避的に、他の非標的ＧＰＣＲ及び膜結合タンパク質、並びにバイオセラピューティックの選択及び生産工程において望ましくない抗原として作用し得るリポタンパク質、アポリポタンパク質、脂質、ホスホインソシトール脂質及びリポ多糖類などの他の膜成分を含むからである。]
発明が解決しようとする課題

[0008] 本発明者らは、特に生物学的に有意義な形態でＧＰＣＲを安定化するための方法を開発した。その様な受容体は、免疫原として及び／又は結合パートナーの作製のための選択及びスクリーニング試薬として多くの利点を有する。特に、それらは、多くの場合機能的特性を有し、これまで作製が非常に困難であることが証明されてきた立体構造特異的な結合パートナーの作製のために有用である。]
[0009] 例えば、発現、可溶化及び精製工程を通じて天然の正しく折りたたまれた受容体の安定性は、精製ＧＰＣＲの高い収率（実験室規模の細胞培養からのミリグラム量）を促進する。さらに、機能の変化を伴わない、一連の界面活性剤及び可溶化緩衝剤及び添加剤中での折りたたまれたタンパク質の安定性は、免疫のため、変性を伴わない固体表面への固定化（例えば、プラスチックプレート、樹脂、ビーズ若しくはスライドガラスに直接若しくはポリヒスチジンタグなどの親和性タグを介して）のため、抗体の作製及びスクリーニングのため、又はライブラリーのスクリーニングのため（アフィボディ、抗体、ファージ若しくは低分子ライブラリーなど）の条件の最適化を可能にする。ライブラリーのスクリーニングに関しては、膜性物質及び細胞表面の「付着性抗原（ｓｔｉｃｋｙ ａｎｔｉｇｅｎｓ）」の除去によって非特異的結合を低減することにより、シグナル／ノイズ比の大きな改善が得られる。高度に極性の又は荷電した頭部基を有する短鎖の界面活性剤（ラウリルジメチルアミン−オキシド、オクチルＤ−グルコシド又はオクチルＤ−マルトシドなど）を使用することも可能になり、それにより、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシドなどのより長鎖の界面活性剤によって隠されているＧＰＣＲのより大きな割合の抗原性表面が明らかにされる（Ｂａｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ １０３（２００６）１６２２４−１６２２９）。受容体の特定の機能的立体構造を捕捉することも、立体構造特異的な機能的結合パートナーを作製する可能性を高める。]
課題を解決するための手段

[0010] したがって、本発明の第一の態様は、ＧＰＣＲの結合パートナーを生産する方法であって、
ａ）親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造において増大した安定性を有する、該親ＧＰＣＲのＧＰＣＲ変異体を提供する工程、
ｂ）１つ又は複数の試験化合物を提供する工程、
ｃ）前記１つ又は複数の試験化合物の各々が、特定の立体構造を備えた前記ＧＰＣＲ変異体に結合するか否かを測定する工程、及び
ｄ）前記特定の立体構造を備えた前記ＧＰＣＲ変異体に結合する試験化合物を単離する工程
を含む方法を提供する。]
[0011] 「結合パートナー」によって、本願では、特定ＧＰＣＲに結合する分子が意味される。好ましくは、前記分子はＧＰＣＲに選択的に結合する。例えば、前記結合パートナーは、少なくとも１つの他のＧＰＣＲに対するよりも少なくとも５倍又は１０倍低い（すなわち、より高い親和性）、好ましくは１００倍又は５００倍以上低いＫｄ値（解離定数）を有することが好ましい。より好ましくは、ＧＰＣＲの結合パートナーは少なくとも１つの他のＧＰＣＲに対するよりも１０００倍又は５０００倍以上低いＫｄ値を有する。しかしながら、限界値は結合パートナーの性質に依存して変化すると解されるであろう。かくして、典型的には、低分子結合パートナーに関しては、結合パートナーは、典型的には少なくとも１つの他のＧＰＣＲに対するよりも少なくとも５０倍又は１００倍低いＫｄ値を有する。典型的には、抗体結合パートナーに関しては、結合パートナーは、典型的には少なくとも１つの他のＧＰＣＲに対するよりも少なくとも５００倍又は１０００倍低いＫｄ値を有する。]
[0012] 特定の立体構造に捕捉された安定化ＧＰＣＲの使用により、立体構造特異的結合パートナーが生産される可能性が増大する。したがって、当該方法はＧＰＣＲの立体構造特異的結合パートナーを生産するために使用してよいと解される。かくして、前記方法は、ＧＰＣＲが安定化された立体構造によって決定されるアゴニスト又はアンタゴニスト（又は他の薬理学的分類）などの機能的活性を有する結合パートナーを同定するためにも使用してよい。]
[0013] 「立体構造特異的」によって、本願では、ＧＰＣＲの結合パートナーがＧＰＣＲの特定構造に選択的に結合し、したがって、同じＧＰＣＲの他の立体構造についてのＫｄ値よりも低いその立体構造についてのＫｄ値を有することが意味される。かくして、立体構造特異的結合パートナーは、ＧＰＣＲの１つの立体構造に結合する（そしてＧＰＣＲにこの立体構造を採用させ得る）が、ＧＰＣＲが採用することが可能な他の立体構造に対しては強く結合しない。したがって、２つの立体構造と立体構造特異的結合パートナーの間の親和性の差は小さくてもよいが、典型的には、立体構造状態の間の平衡を変化させ、ＧＰＣＲが特定の立体構造をとることを促進するのに十分であると解されるであろう。かくして、立体構造特異的結合パートナーは、ＧＰＣＲを生物学的に有意義な立体構造（例えば、リガンド結合状態）に捕捉するものであると解されてよい。典型的には、立体構造特異的結合パートナーは、ＧＰＣＲ立体構造の少なくとも１つの他の立体構造に対するよりも少なくとも５倍又は１０倍低い（すなわち、より高い親和性）、好ましくは１００から１００００倍低いＫｄ値（解離定数）を有する。]
[0014] 典型的には、立体構造特異的結合パートナーは、ｍＭからｐＭ又はｍＭからｆＭ、例えばμＭからｎＭの範囲又はｎＭからｐＭの範囲のＫｄでＧＰＣＲに結合する。]
[0015] Ｋｄ値は、当該技術分野でよく知られた方法を用いて及び、例えば以下に記載するように、容易に測定することが可能である。平衡時のＫｄ＝［Ｒ］［Ｌ］／［ＲＬ］
［式中、角括弧内の用語は、
・受容体−リガンド複合体［ＲＬ］
・未結合受容体［Ｒ］、及び
・未結合（「遊離」）リガンド［Ｌ］
の濃度を表す］。]
[0016] Ｋｄを測定するためにはこれらの用語の値が既知でなければならない。受容体の濃度は通常既知ではないので、その場合はＨｉｌｌ−Ｌａｎｇｍｕｉｒの式：
部分占有率＝［Ｌ］／［Ｌ］＋Ｋｄ
が使用される。]
[0017] 実験的にＫｄを測定するためには、平衡時の遊離リガンドと結合リガンドの濃度が既知でなければならない。典型的には、これは、放射標識又は蛍光標識リガンドを使用して、それを平衡に達するまで受容体（全細胞中又はホモジナイズされた膜中に存在する）と共にインキュベートすることによって実施されてよい。結合リガンドと遊離リガンドからのシグナルを分離することによって遊離リガンドと結合リガンドの量が測定できなければならない。放射性リガンドの場合、これは、溶液中の遊離リガンドから全細胞又は膜上に存在する結合リガンドを分離するための遠心分離又はろ過によって実施されてよい。代替的には、シンチレーション近接アッセイが使用される。このアッセイでは、受容体（膜中の）はシンチラントを含むビーズに結合されており、ビーズに固定化された受容体に結合した放射性リガンドが近接することによってのみシグナルが検出される。]
[0018] 親和性定数も機能的アッセイ（ＫＢ）において測定してよい。この場合、全細胞中又は膜中の受容体は、アゴニストリガンド及び測定される応答（例えば、細胞内カルシウムの可動化、Ｇタンパク質の活性化、アデニル酸シクリーゼ若しくはｃＡＭＰの増加若しくは減少、ＭＡＰ−キナーゼ経路などのシグナル伝達経路の活性化又は遺伝子転写の活性化）によって活性化される。アゴニスト活性を阻害するアンタゴニストの能力を測定してもよく、競争的アンタゴニストに関しては、この能力は親和性定数に等しい。]
[0019] 一連の洗浄剤、界面活性剤及び可溶化剤緩衝液中のＧＰＣＲ変異体の安定性は、それらの通常の膜環境の外でそれらを精製することを可能にする。したがって、ＧＰＣＲは、非標的ＧＰＣＲなどの望ましくない抗原、膜結合タンパク質、並びにリポタンパク質、アポリポタンパク質、脂質、ホスホイノシトール脂質及びリポ多糖類などの他の膜成分から取り出された単離形態で提供されてよい。かくして、本発明の方法は、その様な望ましくない抗原の非存在下でＧＰＣＲの結合パートナーを選択することを可能にする。かくして本発明は、他の膜成分に比べてＧＰＣＲに対して高い選択性を有する結合パートナーを生産する。]
[0020] 特定の立体構造における安定性を付与する親ＧＰＣＲの変異は、特定の立体構造を備える親ＧＰＣＲの特定結合パートナーへの結合には影響を及ぼさないと予想される。しかしながら、一度結合パートナーが、特定の立体構造を備えるＧＰＣＲ変異体への結合を評価することによって単離されれば、同じ特定の立体構造を備える親ＧＰＣＲへのその結合パートナーの結合も評価されてよいと解される。]
[0021] かくして、１つの実施態様では本発明の方法は、
（ｅ）各々の試験化合物が前記特定立体構造を備える場合の親ＧＰＣＲに結合するか否かを測定する工程、及び
（ｆ）前記特定立体構造を備える場合の親ＧＰＣＲにも結合する前記試験化合物を単離する工程
をさらに含む。]
[0022] 典型的には、前記選択した結合パートナーは、同じ特定の立体構造を備える場合の親ＧＰＣＲに対する結合と同様の作用強度で特定の立体構造を備える場合のＧＰＣＲ変異体に結合する。典型的には、ＧＰＣＲ変異体と親ＧＰＣＲに結合する特定の結合パートナーについてのＫｄ値は、互いに５から１０倍以内、例えば２から３倍以内である。典型的には、親ＧＰＣＲと比較してＧＰＣＲ変異体に対する結合パートナーの結合は、最大で５倍弱く、最大で１０倍強いであろう。]
[0023] 典型的には、前記選択した結合パートナーは、同じ立体構造を備える場合の親受容体とほぼ等しい親和性（すなわち、典型的には２から３倍以内）又はより高い親和性でＧＰＣＲ変異体に結合する。アゴニスト立体構造変異体に関しては、当該変異体は、典型的には親ＧＰＣＲと同じか又はより高い親和性でアゴニスト立体構造特異的結合パートナーに結合し、典型的には親ＧＰＣＲと同じか又はより低い親和性でアンタゴニスト立体構造特異的結合パートナーに結合する。アンタゴニスト立体構造変異体についても同様に、当該変異体は、典型的には親ＧＰＣＲと同じか又はより高い親和性でアンタゴニスト立体構造特異的結合パートナーに結合し、典型的には親ＧＰＣＲと同じか又はより低い親和性でアゴニスト立体構造特異的結合パートナーに結合する。]
[0024] ＧＰＣＲの特定の立体構造に対する又は特定のＧＰＣＲに対する結合パートナーの選択性及びＫｄの計算は、当該技術分野でよく知られた結合アッセイを用いて及び、例えば、以下に記載するように決定してよい。典型的には、Ｋｄ値は、各種の化合物濃度での結合親和性を測定する、膜における従来のＧＰＣＲアッセイを使用して計算される。適切なアッセイの例は、表面プラズモン共鳴アッセイ、及び当該技術分野でよく知られており、以下に記載する競合アッセイを含む。]
[0025] 典型的には、本態様において使用するＧＰＣＲ変異体は、以下に記載する方法のいずれかを使用して選択され、調製される。]
[0026] 親ＧＰＣＲのＧＰＣＲ変異体を提供する工程

親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体は、以下に記載する方法によって、並びにＰＣＴ出願ＷＯ ２００８／１１４０２０号及びＰＣＴ／ＧＢ２００８／００４０３２号に開示されている方法の任意のものによって提供されてよい。]
[0027] 方法１

増大した安定性を有するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）変異体を選択するための方法は、

（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、
（ｂ）親ＧＰＣＲが特定の立体構造を備えている際に前記ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択する工程、
（ｃ）前記選択したリガンドの結合に関する親ＧＰＣＲの安定性と比較して、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が前記リガンド結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、並びに
（ｄ）前記選択したリガンドの結合に関して、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程
を含む。]
[0028] 本発明者は、生物学的に有意義な形態（すなわち、薬理学的に有用な形態）におけるＧＰＣＲの結晶化可能性を改善するために、前記タンパク質の安定性を増大するだけではなく、前記タンパク質が特定の立体構造にある際に増大した安定性を有することが望ましいと解している。前記立体構造は、選択したリガンドによって決定され、生物学的に有意義な立体構造、特に薬理学的に有意義な立体構造である。かくして、前記選択方法は、特定の立体構造の増大した安定性を有するＧＰＣＲの変異体を選択するための方法であると解されてよく、例えば、それらは増大した熱安定性の立体構造を有してもよい。前記方法を使用して、安定な立体構造が固定されたＧＰＣＲを変異誘発によって作製してよい。選択されたＧＰＣＲ変異体は、より高い割合のものが特定の立体構造の状態である点で、親分子よりも純度が高い形態である。したがって、この立体構造に選択的に結合する１つ又は複数のリガンドを使用することによって他の立体構造から分離される当該受容体立体構造の慎重な選択は、前記選択方法の重要な特徴である。前記方法は、より結晶化に供しやすいＧＰＣＲ変異体を選択するための方法であると解されてもよい。これは、分子の集団内での低い均一性又は高い多面作用が結晶化にとって好ましくなく、さらに、特定分子の立体構造の数が多いことも結晶化には不利に働くことがよく知られているからである。]
[0029] かくして、増大した安定性を有するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）変異体を選択するための更なる方法は、
（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、
（ｂ）親ＧＰＣＲが特定の立体構造を備えている際に前記ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択する工程、
（ｃ）前記選択したリガンドの結合に関する同じ特定の立体構造を備えた親ＧＰＣＲの安定性と比較して、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が、特定の立体構造を備えている際に、前記リガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、並びに
（ｄ）前記選択したリガンドの結合に関して、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程
を含む。]
[0030] Hopkins &Groom (2002) Nature Rev. Drug Discovery 1, 727-730 による新薬の開発につながるようなゲノムのレヴューにおいて、表１には、その多数がＧＰＣＲであるタンパク質ファミリーの一覧が含まれている。Overington et al (2006) Nature Rev. Drug Discovery 5, 993-996 は、薬剤標的のより詳細な記載を提供しており、図１は、四分の一超の現在の薬剤がＧＰＣＲを標的とすることを示している。経口薬の１８６種の全標的のうち、５２種のＧＰＣＲ標的が存在する。] 図１
[0031] 本発明において使用するのに適切なＧＰＣＲは、β−アドレナリン受容体、アデノシン受容体、特に、アデノシンＡ２ａ受容体、及びニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）を含むが、それらに限らない。他の適切なＧＰＣＲは当該技術分野においてよく知られており、上述のHopkins & Groom (2002) Nature Rev. Drug Discovery 1, 727-730に挙げられているものを含む。加えて、International Union of Pharmacologyは、ＧＰＣＲの一覧を作成しており（参照によって本明細書に取り込むFoord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57,279-288、当該一覧は、http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardにおいて定期的に更新されている）。ＧＰＣＲは、それらのアミノ酸配列の類似性に基づいて、各種の異なる種類に分類されることに注意されるであろう。それらは、それらが結合する天然のリガンドによるファミリーにも分類される。全てのＧＰＣＲが本発明の範囲に含まれる。]
[0032] 多数のＧＰＣＲのアミノ酸配列（及びそれらをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列）は、例えばＧｅｎＢａｎｋを参照することによって、容易に利用可能である。特に、Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288は、Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)に由来するヒトの遺伝子記号並びにヒト、マウス、及びラットの遺伝子ＩＤを挙げている。ヒトゲノムの配列は実質的に完全であるため、ヒトＧＰＣＲのアミノ酸配列は、そこから推定し得ることに注意すべきである。]
[0033] ＧＰＣＲは任意の起源に由来してよいが、真核生物起源に由来することが特に好ましい。哺乳類又は鳥類などの脊椎動物に由来することは特に好ましい。ＧＰＣＲがラット、マス、ウサギ、若しくはイヌ、又はヒトを除く霊長類若しくはヒト、又はニワトリ若しくはシチメンチョウに由来することが特に好ましい。誤解を避けるために、「由来する」の意味には、ｃＤＮＡ又は遺伝子がその起源に由来する遺伝子材料を用いて元々得られたが、タンパク質がその後に任意の宿主細胞において発現されてよいことを含める。かくして、真核生物のＧＰＣＲ（鳥類又は哺乳類のＧＰＣＲ）が、大腸菌などの原核生物の宿主細胞で発現されてよいが、場合によって、鳥類又は哺乳類由来であると解されることは明らかである。]
[0034] ある場合においては、ＧＰＣＲは、２以上の異なるサブユニットからなってよい。例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体は、その生理学的なリガンド結合特性を獲得するために、一回膜貫通へリックスタンパク質（ＲＡＭＰ１）の結合を必要とする。ＧＰＣＲと結合して機能的な複合体を形成又は調節するエフェクタータンパク質、付属タンパク質、補助タンパク質、又はＧＰＣＲ相互作用タンパク質は当該技術分野においてよく知られており、例えば、受容体キナーゼ、Ｇタンパク質、及びアレスチンを含む（Bockaert
et al (2004) Curr Opinion Drug Discov and Dev 7, 649-657）。]
[0035] 親ＧＰＣＲの変異体は、任意の適切な方法で生産されてよく、任意の適切な形態で提供されてよい。かくして、例えば、親タンパク質の全て又は一部における各アミノ酸残基が独立に他のアミノ酸残基に変換された、親タンパク質の一連の特定の変異体が作製されてよい。例えば、膜を貫通していると予測されるタンパク質の部分に変異を作製することが好都合であってよい。ロドプシンの三次元構造は既知であり（Li et al (2004) J Mol Biol 343, 1409-1438; Palczewski et al (2000) Science 289, 739-745）、当該構造を使用してあるＧＰＣＲのモデルを作製することが可能である。かくして、簡便には、ＧＰＣＲの変異させる部分は、モデルに基づくものであってよい。同様に、疎水性に基づいてＧＰＣＲの膜貫通領域のモデルを作製するコンピュータープログラムを利用することも可能であり（Kyle & Dolittle (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132）、タンパク質の変異させる部分を選択する際にその様なモデルを使用してよい。従来の部位指向性変異導入を使用してよく、又は当該技術分野においてよく知られたポリメラーゼ連鎖反応に基づく手法を使用してよい。望ましいものではないが、タンパク質変異体の選択にリボソームディスプレイ法が使用されてもよい。]
[0036] 典型的には、選択された各アミノ酸をＡｌａに置き換える（すなわち、Ａｌａスキャニング変異誘発）が、任意の他のアミノ酸に置き換えてもよい。選択したアミノ酸がＡｌａである場合は、好都合には、Ｌｅｕによって置き換えてもよい。代替的には、前記アミノ酸はＧｌｙに置き換えてもよく（すなわち、Ｇｌｙスキャニング変異誘発）、これは、特定の立体構造にあるタンパク質を固定化してよい隣接するヘリックスのより近接したパッキングを可能にする。選択されたアミノ酸がＧｌｙである場合は、好都合には、Ａｌａによって置き換えてよい。]
[0037] 特定の位置における所定のアミノ酸を置き換えるのに使用されるアミノ酸は、典型的には天然のアミノ酸、特に「コード可能な」アミノ酸であるが、非天然アミノ酸（この場合、典型的には、タンパク質は、化学合成又は非天然アミノ酸アシルｔＲＮＡを使用して作製される）であってよい。「コード可能な」アミノ酸は、ｍＲＮＡの翻訳によってポリペプチドに取り込まれるものである。非天然アミノ酸を作製し、又は、例えば、タンパク質の翻訳後修飾若しくは半合成によって共有結合性の化学修飾によって所定の位置に非ペプチド結合を導入することが可能である。これらの翻訳後修飾は、リン酸化、糖鎖付加、又はパルミトイル化などの天然のものであるか又は合成若しくは生合成によるものであってよい。]
[0038] 代替的には、前記変異体は、タンパク質全体又はその選択した一部に対するものであってよいランダム変異誘発法によって生産されてよい。ランダム変異誘発法は当該技術分野でよく知られている。]
[0039] 好都合には、前記ＧＰＣＲ変異体は、親タンパク質と比較して、１つの置き換わったアミノ酸を有する（すなわち、１つのアミノ酸部位において変異を有する）。このように、単独のアミノ酸を置き換えることによる安定性に対する寄与が評価されてよい。しかしながら、安定性について評価されるＧＰＣＲ変異体は、親タンパク質と比較して２以上、例えば、２、３、４、５、又は６つの置き換わったアミノ酸を有してもよい。]
[0040] 以下により詳細に議論しているように、変異の組み合わせが、本発明の選択方法の結果に基づいて為されてよい。幾つかの特定の態様では、１つの変異を有するタンパク質における変異の組み合わせが、安定性における更なる向上を誘導することが認められた。かくして、前記選択方法は、例えば、当該方法を実施して安定性を増大する単一の変異を同定し、当該方法の工程（ａ）において提供される１つのＧＰＣＲ変異体においてそれらの同定した変異を組み合わせることによって、繰り返し使用してよいと解されるであろう。かくして、多数の変異を有するタンパク質変異体が、本発明の方法を使用して選択されてよい。]
[0041] 親ＧＰＣＲは、天然のタンパク質である必要はない。好都合には、大腸菌などの適切な宿主生物中で発現することが可能な遺伝子操作を受けたものであってよい。例えば、実施例１に記載の、好都合に操作したシチメンチョウβ−アドレナリン受容体は、切断されており、アミノ酸配列の１〜３３残基を欠失している（すなわち、βＡＲ３４−４２４）。親ＧＰＣＲは、天然のタンパク質の切断型であるか（一方又は両方の末端が切断されている）、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよい。代替的又は付加的に、親ＧＰＣＲは、天然のＧＰＣＲと比較して、例えば、可溶性、タンパク質分解安定性を改善するために修飾されてよい（例えば、切断、ループの欠失、グリコシル化部位の変異、又はシステインなどの反応性アミノ酸側鎖の変異）。いずれにしても、親ＧＰＣＲは、天然のＧＰＣＲに結合することが既知のものである、選択したリガンドに結合することが可能なタンパク質である。好都合には、親ＧＰＣＲは、適当なリガンドを加えて、Ｇタンパク質活性化によって影響を受けることが一般的に知られている１つ又は複数の下流の活性の任意のものに作用してよい。]
[0042] しかしながら、前記変異体の安定性は、安定性における増大を評価できるため、親と比較されると解されるであろう。]
[0043] 特定の立体構造を備えている親ＧＰＣＲに結合するリガンドが選択される。典型的には、前記リガンドは、親ＧＰＣＲの１つの立体構造に結合する（そして、前記ＧＰＣＲに当該立体構造をとらせる）が、ＧＰＣＲが採用し得ない他の立体構造に強力に結合することはない。かくして、前記リガンドの存在は、ＧＰＣＲが特定の立体構造をとらせることを促進すると解されてよい。かくして、本発明の方法は、生物学的に有意義な立体構造（例えば、リガンド結合状態）に捕らわれ、当該立体構造でより安定であるＧＰＣＲ変異体を選択する方法であると解されてよい。]
[0044] 好ましくは、ＧＰＣＲが工程（ｃ）で備える特定の立体構造が、工程（ｂ）で選択されるリガンドの種類と対応する。]
[0045] 好ましくは、前記選択されるリガンドはアゴニストに分類されるリガンド由来のものであり、前記特定の立体構造はアゴニスト立体構造であるか、又は前記選択されるリガンドはアンタゴニストに分類されるリガンド由来のものであり、前記特定の立体構造はアンタゴニスト立体構造である。]
[0046] 好ましくは、前記選択されるリガンドはアゴニストに分類されるリガンドに由来し、ＧＰＣＲが工程（ｃ）で備える特定の立体構造がアゴニスト立体構造である。]
[0047] 好ましくは、受容体変異体に対する前記選択されるリガンドの結合親和性は、野生型の受容体に対するもの以上であり、選択されるリガンドに対して顕著に低減した結合を示す変異体は、典型的には、除外される。]
[0048] 「リガンド」によって、本願では、ＧＰＣＲに結合し、且つ、ＧＰＣＲに特定の立体構造をとらせる任意の分子が含まれる。好ましくは、前記リガンドは、ＧＰＣＲ分子全体の半分超に特定の立体構造をとらせるものである。]
[0049] 多数の適切なリガンドが既知である。]
[0050] 典型的には、前記リガンドは完全なアゴニストであり、ＧＰＣＲに結合することが可能であり、例えば、Ｇ−タンパク質結合、下流のシグナル伝達現象、又は血管拡張などの生理学的なアウトプットによって測定される、完全な（１００％の）生物学的応答を誘導することが可能である。かくして、典型的には、前記生物学的応答は、関連するエフェクター経路の刺激後のＧ−タンパク質におけるＧＤＰ／ＧＴＰ交換である。前記測定は、典型的には、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換又はその経路の最終産物（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、又はリン酸イノシトール）のレベルにおける変化である。前記リガンドは、部分的アゴニストであり、ＧＰＣＲに結合することが可能であり、部分的（＜１００％）な生物学的応答を誘導することが可能である。]
[0051] 前記リガンドは、受容体に結合する分子であり、その基礎的な（すなわち、アゴニストによって刺激されていない）活性を場合によっては０にまでも低減する逆アゴニストであってもよい。]
[0052] 前記リガンドは、受容体に結合し、アゴニストの結合を阻害して、生物学的応答を妨げるアンタゴニストであってもよい。逆アゴニスト及び部分的アゴニストは、あるアッセイ条件下では、アンタゴニストとなり得る。]
[0053] 上記リガンドは、オルトステリック（orthosteric）であってよく、これは、それらが内在性アゴニストと同じ部位に結合するという意味を含む。または、それらはアロステリック（allosteric）又はアロトピック（allotopic）であってよく、これは、それらがオルトステリック部位と異なる部位に結合するという意味を含む。上記リガンドはシントピック（syntopic）であってよく、これは、それらが同じ又は重複する部位で他のリガンドと相互作用するという意味を含む。それらは、可逆的又は非可逆的であってよい。]
[0054] アンタゴニストに関しては、サーマウンタブル（surmountable）であってよく、これは、アゴニストの最大の効果が、アンタゴニストを用いた事前処理又は同時処理によって低減されないという意味を含み；或いは、それらはインサーマウンタブル（insurmountable）であってよく、これは、アゴニストの最大の効果が、アンタゴニストの事前処理又は同時処理のいずれかによって低減されるという意味をふくみ；或いは、それらはニュートラル（neutral）であってよく、これは、アンタゴニストが逆アゴニスト又は部分的アゴニスト活性を有しないものであるという意味を含む。典型的には、アンタゴニストは、逆アゴニストでもある。]
[0055] 前記選択方法に使用するリガンドは、ポジティブアロステリックモジュレータ、ポテンシエーター、ネガティブアロステリックモジュレータ、及びインヒビターなどのアロステリックモジュレータであってもよい。それらは、それら自体でアゴニスト又は逆アゴニストとしての活性を有してよく、又はそれらはアゴニスト又は逆アゴニストの存在下でのみ活性を有してよく、その場合には、ＧＰＣＲと結合するためにその様な分子と組み合わせて使用される。]
[0056] 参照によって本明細書に取り込むNeubig et al (2003) Pharmacol. Rev. 55, 597-606は、各種のリガンドを開示している。]
[0057] 好ましくは、上述のリガンドは、低分子の有機又は無機成分であるが、ペプチド又はポリペプチドであってよい。典型的には、前記リガンドが低分子の有機又は無機成分である際は、５０から２０００、１００から１０００など、例えば、１００から５００のＭｒを有する。]
[0058] 典型的には、前記リガンドは、ｍＭからｐＭ、例えばμＭ（マイクロモーラー）からｎＭの範囲のＫｄでＧＰＣＲに結合する。一般的には、最も低いＫｄを有するリガンドが好ましい。]
[0059] 有機低分子のリガンドは、当該技術分野においてよく知られており、例えば、以下の実施例を参照のこと。他の低分子のリガンドは、５ＨＴ１Ａ受容体において完全なアゴニストである５ＨＴ；５ＨＴ１Ａ受容体に部分的なアゴニストであるエルトプラジン（Newman-Tancredi et al (1997) Neurophamacology 36, 451-459参照）；ドーパミンＤ２受容体アゴニストである（＋）−ブタクラモール及びスピペロン（Roberts & Strange (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 34-42参照）；並びにＣＢ２のニュートラルアゴニストであるＷＩＮ５５２１２−３（Savinainen et al (2005) Br. J. Pharmacol. 145, 636-645 ）を含む。]
[0060] 前記リガンドは、ペプチドミメティック、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はアプタマーであってよい。Ｎａ＋又はＺｎ２＋などのイオン、オレアミドなどの脂質、又はヘパリンなどの炭水化物であってもよい。]
[0061] 前記リガンドは、ＧＰＣＲに結合するポリペプチドであってよい。そのようなポリペプチド（オリゴペプチド含む）は、典型的には、Ｍｒ５００からＭｒ５０，０００のであるが、それより大きいものであってもよい。前記ポリペプチドは、天然のＧＰＣＲ相互作用タンパク質又はＧＰＣＲと相互作用する他のタンパク質又はその誘導体若しくは断片であってよいが、特定の立体構造にあるＧＰＣＲに選択的に結合するものである。ＧＰＣＲ相互作用タンパク質は、シグナル伝達と関連するもの及び輸送に関連するものを含み、多くの場合においては、ＧＰＣＲのＣ末端部分のＰＤＺドメインを介して作用する。]
[0062] あるＧＰＣＲに結合することが既知のポリペプチドは、Ｇタンパク質、アレスチン、ＲＧＳタンパク質、Ｇタンパク質受容体キナーゼ、ＲＡＭＰ、１４−３−３タンパク質、ＮＳＦ、ペリプラキン、スピノフィリン、ＧＰＣＲキナーゼ、レセプターチロシンキナーゼ、イオンチャンネル又はそのサブユニット、アンキリン、並びにＳｈａｎｋｓ又はＨｏｍｅｒタンパク質の任意のものを含む。他のポリペプチドは、ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１又はＮＲ２ａ、カルシオン、又はフィブロネクチンドメインフレームワークを含む。前記ポリペプチドは、フィブリンー１などのＧＰＣＲの細胞外ドメインに結合するものであってよい。前記ポリペプチドは、ヘテロオリゴマーにおいて選択したＧＰＣＲを結合する他のＧＰＣＲであってよい。ＧＰＣＲにおけるタンパク質−タンパク質相互作用のレヴューは、参照によって本明細書に取り込むMilligan & White (2001) TrendsPharmacol. Sci. 22, 513-518 又はBockaert et al (2004) Curr. Opinion Drug Discov. Dev. 7, 649-657 において認められる。]
[0063] ポリペプチドリガンドは、好都合には、ＧＰＣＲに結合する抗体であってよい。用語「抗体」によって、本願では、天然であるか又は部分的に若しくは完全に合成によって生成されたかにかかわらず、免疫グロブリンが含まれる。例としては、免疫グロブリンアイソタイプ及びそれらのアイソタイプサブクラス、並びにモノクローナル抗体及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）及びダイアボディ（diabody）などの抗原結合ドメインを含むそれらの断片が含まれる。ラクダ科の動物の抗体及びラクダ科の抗体であって遺伝子操作したものも挙げられてよい。ＧＰＣＲに結合するその様な分子は当該技術分野において既知であり、任意に、既知の技術を使用して作製されてよい。適切な抗体は、立体構造エピトープを認識する傾向があるため、ＧＰＣＲに対するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で現在使用されているものである。]
[0064] 前記ポリペプチドは、アンキリンリピートタンパク質、アルマジロリピートタンパク質、ロイシンリッチタンパク質、テトラトリオペプチドリピートタンパク質、又は設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰ）などのモジュールフレームワークに基づく結合タンパク質、或いはリポカリン若しくはフィブロネクチンドメイン又はヒトγクリスタリン若しくはヒトユビキチンのいずれかに基づくアフィリンスカフォールド（affilin scaffold）であってもよい。]
[0065] 前記選択方法の１つの実施態様では、前記リガンドはＧＰＣＲに共有結合し、例えば、Ｇタンパク質又はアレスチン融合タンパク質などである。幾つかのＧＰＣＲ（例えば、トロンビン受容体）は、プロテアーゼによってＮ末端で切断され、新しいＮ末端はアゴニスト部位と結合する。かくして、その様なＧＰＣＲは天然のＧＰＣＲ−リガンド融合体である。]
[0066] 抗体又は他の「ユニバーサルな」結合ポリペプチド（例えば、多数の異なるＧＰＣＲに結合することが既知のＧタンパク質）の使用は、天然のリガンド及び低分子リガンドが未知の「オーファン」ＧＰＣＲに対する本発明の方法の使用において特に有利であり得ると解されるであろう。]
[0067] 一度リガンドが選択されると、当該選択したリガンドの結合に関して親ＧＰＣＲと比較して、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が、前記リガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かが測定される。当該工程（ｃ）は、選択したリガンドによって決定される特定の立体構造について、前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が（親と比較して）増大した安定性を有するか否かを測定するものである。かくして、前記ＧＰＣＲ変異体は、選択したリガンド結合の間に測定されるか又はリガンド結合によって測定される、選択したリガンドの結合の結合に関して増大した安定性を有する。以下に記載するように、増大した安定性が、選択したリガンドの結合の間に評価されることが好ましい。]
[0068] 増大した安定性は、好都合には、不安定にする可能性がある曝露条件下（例えば、熱、強力な界面活性剤条件、及びカオトロピック剤など）における、前記変異体の寿命の延長によって測定される。前記曝露条件下における不安定化は、典型的には、変性又は構造の損失の測定によって測定される。以下に記載するように、これは、リガンド結合能の損失又は二次若しくは三次構造の指標の損失によって現れる。]
[0069] 以下の図１２（特に好ましい実施態様を記載する）に関して記載するように、ＧＰＣＲ変異体の安定性を測定するために使用してよい各種のアッセイ形式が存在する。] 図１２
[0070] １つの実施態様では、前記ＧＰＣＲ変異体を、当該変異体の安定性を測定する方法に供する前にリガンドと接触させる（前記ＧＰＣＲ変異体及びリガンドは、試験の間に接触した状態のままである）。かくして、例えば、本発明の方法が、１つの立体構造においてリガンドと結合し、且つ、改善された熱安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択するために使用される際は、前記受容体を、加熱される前に前記リガンドと接触させ、次いで、加熱後に前記受容体に結合しているリガンドの量を使用して、親受容体との比較における熱安定性を表わしてよい。これによって、変性条件（例えば、熱）に曝露した後にリガンド結合能を保持しているＧＰＣＲの量の測定が提供され、これが安定性の指標である。]
[0071] 代替的（であるが上記のものよりは好ましいものではない）実施態様では、前記ＧＰＣＲ変異体を、前記リガンドと接触させる前に、前記変異体の安定性を測定する手法に供する。かくして、例えば、本発明の方法が、１つの立体構造においてリガンドと結合し、且つ、改善された熱安定性を有する膜受容体変異体を選択するために使用される際は、前記リガンドと接触させる前に、まず前記受容体を加熱し、次いで、前記受容体に結合したリガンドの量を使用して熱安定性を表わしてよい。そして、これによって、変性条件に曝露した後にリガンド結合能を保持しているＧＰＣＲの量の測定が提供される。]
[0072] 双方の実施態様において、前記変異体の安定性の比較が、同一の条件下における親分子を参照することによって為されると解されるであろう。]
[0073] これらの実施態様の双方において、選択された変異体は、親タンパク質と比較して、特定の立体構造を備える際に増大した安定性を有するものである。]
[0074] 好ましい経路は、特定のＧＰＣＲに依存し、リガンドの非存在下におけるタンパク質のとり得る立体構造の数に依存するであろう。図１２に記載の実施態様では、所望の立体構造が選択される可能性を増大するため、リガンドが加熱工程の間に存在することが好ましい。] 図１２
[0075] したがって、前記選択方法は、増大した熱安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択するための方法であって、（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、（ｂ）前記親ＧＰＣＲに結合するアンタゴニスト又はアゴニストを選択する工程、（ｃ）前記アンタゴニスト又はアゴニストの存在下において、特定の温度で特定の時間の後にＧＰＣＲ変異体の前記選択したアンタゴニスト又はアゴニストへの結合能を測定することによって、前記変異体又はその各々が親ＧＰＣＲと比較して増大した熱安定性を有するか否かを測定する工程、及び（ｄ）同一の条件下における親ＧＰＣＲよりも、特定の温度で特定の時間の後に前記選択したアンタゴニスト又はアゴニストのより多くと結合するＧＰＣＲ変異体を選択する工程を含む方法を包含すると解されるであろう。工程（ｃ）では、特定の温度における一定の期間が、典型的には、前記選択したアンタゴニスト又はアゴニストと結合するＧＰＣＲ変異体の能力の測定において使用される。工程（ｃ）では、典型的には、選択した前記アンタゴニスト又はアゴニストの結合が当該温度で一定期間の間に５０％低減する（５０％の受容体が不活化されていることを示す：「見かけ上の」Ｔｍ）温度及び時間が選択される。]
[0076] 好都合には、前記リガンドを使用してＧＰＣＲをアッセイする（すなわち、前記アッセイを使用して非変性状態であるか否かを測定する）際は、前記リガンドは可視的に標識、例えば、放射標識又は蛍光標識される。他の実施態様では、リガンド結合は、二次検出系、例えば、抗体又は検出部位に共有結合する他の高親和性結合パートナー、例えば、比色分析において使用されてよい酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ）を使用して、未結合のリガンドの量を測定することによって評価されてよい。ＦＲＥＴ法が使用されてもよい。その安定性の測定においてＧＰＣＲ変異体をアッセイするために使用するリガンドは、前記方法の工程（ｂ）において選択されるものと同じリガンドである必要はないと解されるであろう。]
[0077] リガンド結合能を非変性タンパク質の存在の指標として使用して、親ＧＰＣＲ及びＧＰＣＲ変異体の安定性を測定することが好都合であるが、他の方法が当該技術分野で知られている。例えば、内在するトリプトファン蛍光の使用又は１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）などの外来性の蛍光プローブの使用のいずれかによる、蛍光スペクトルにおける変化が、アンフォールディングの感度の良好な指標であってよく、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（商標）法（Mezzasalma et al, J Biomol Screening, 2007, Apr;12(3):418-428）において説明されている。タンパク質分解に対する安定性、質量分析器によって測定される重水素／水素交換、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｇｅｌ、キャピラリーゾーン電気泳動、円偏光二色性（ＣＤ）分光法、及び光散乱を使用して、二次又は三次構造と関連するシグナルの損失によってアンフォールディングを測定してよい。しかしながら、これらの方法の全てが、それらを使用する前に、適度な量（例えば、高いｐｍｏｌ／ｎｍｏｌ量）で精製されたタンパク質を必要とするが、実施例に記載の方法は、ｐｍｏｌ量の本質的に未精製のＧＰＣＲを使用する。]
[0078] 好ましい実施態様では、工程（ｂ）において、各々の存在がＧＰＣＲに同一の特定の立体構造を備えさせる、２又はそれ以上の同じ種類のリガンドを選択する。かくして、当該実施態様において、同じ種類の１つ又は複数の（天然又は非天然）リガンド（例えば、完全なアゴニスト又は部分的アゴニスト又はアンタゴニスト又は逆アゴニスト）が使用されてよい。平行して又は連続的に当該方法に同じ種類の多数のリガンドを含めることによって、例えば結合部位において親と実質的に異なるが、代償的変化によって依然としてリガンドに結合することが可能な多数の変性を有する受容体の立体構造を、思わず遺伝子操作及び選択する理論的なリスクが最小化される。以下：
１．例えば結合分析、機能分析、又は分光分析によって根拠付けられる共通の薬理学的分類を有する、化学的に異なるリガンドのセット（例えば、ｎ＝２から５）を選択する工程（これらのリガンドは、例えば野生型受容体及び／又は変異型受容体を使用する競争結合試験並びに／或いはそれらが共通のファーマコフォアを表わす必要は無いが分子モデリングによって根拠付けられるように、受容体の共通の空間的領域に結合すると解されるべきである）；
２．安定性を増大することが意図される１つ又は複数の受容体変異体を作製し、リガンドセットの全てを使用してタイト結合についてアッセイする工程（前記アッセイは、平行、多重、又は連続的に為されてよい）；
３．例えば、各リガンドについての結合等温線の測定によって、及びリガンドを用いた安定性のシフトの測定によって（典型的には、野生型と比較してウィンドウが狭い）、安定化された受容体変異体の確実性を確認する工程を使用して当該リスクを軽減してよい。]
[0079] 変異による結合部位に対する影響によって生じる見掛けの親和性における変化に対する監視のために、好ましくは、同じ薬理学的分類を有するが、異なる化学的分類を有するリガンドを使用して、受容体をプロファイルするべきである。典型的には、これらによって、異なる分子認識特性を有するが、同様の親和性におけるシフト（変異体ｖｓ親、例えば野生型）が示されるべきである。結合実験は、好ましくは、同じ薬理学的分類内の標識リガンドを使用して実施するべきである。]
[0080] それにもかかわらず、同じ薬理学的分類内のリガンドの複数の化学的分類に特異的な立体構造基質が存在する可能性があり、これらは、その手法において、選択したリガンドの化学的分類に依存して特異的に安定化される可能性があることが認識されるべきである。]
[0081] 典型的には、前記選択したリガンドは、親ＧＰＣＲに対する結合と同様の作用強度でＧＰＣＲ変異体に結合する。典型的には、ＧＰＣＲ変異体及び親ＧＰＣＲに対する特定のリガンド結合についてのＫｄ値は、互いに５から１０倍、例えば、２から３倍の範囲である。典型的には、親ＧＰＣＲと比較してＧＰＣＲ変異体に対するリガンドの結合は、最大で５倍弱く、最大で１０倍強いであろう。]
[0082] 典型的には、選択された立体構造で安定化された受容体変異体は、親受容体と同程度（典型的には、２から３倍以内）又はそれ以上の親和性で選択したリガンドに結合するはずである。アゴニスト−立体構造変異体について、前記変異体は、典型的には、親ＧＰＣＲと同じ又はそれ以上の親和性で前記アゴニストと結合し、典型的には、親ＧＰＣＲと同定又はそれ以下の親和性でアンタゴニストと結合する。同様に、アンタゴニスト−立体構造変異体について、前記変異体は、典型的には、親ＧＰＣＲと同じ又はそれ以上の親和性でアンタゴニストと結合し、典型的には、親ＧＰＣＲと同じ又はそれ以下の親和性でアゴニストと結合する。]
[0083] 選択するリガンドについての親和性における顕著な低減（典型的には２から３倍超）を示す変異体は、典型的には除外する。]
[0084] 典型的には、同じ分類を有する一連のリガンドの結合の序列は同程度であるが、当該序列において１つ又は２つの逆転が存在する可能性があり、あるいは一連のリガンドに異常値が存在する可能性がある。]
[0085] 更なる実施態様では、同じ立体構造の受容体に結合する２つ又はそれ以上のリガンド、例えば、アロステリックモジュレータ及びオルトステリックアゴニストを使用してよい。]
[0086] 誤解を避けるために、また、実施例から明らかなように、効果的な方法に多数のリガンドを使用することが必要なわけではない。]
[0087] 更なる実施態様では、選択したリガンドに結合することが可能であるが、第一のリガンドとは異なる分類のものである第二の選択したリガンドには結合できないか又は親ＧＰＣＲより弱く結合するＧＰＣＲ変異体を選択することも有利であってよい。かくして、例えば、ＧＰＣＲ変異体は、選択したアンタゴニストの結合に関して増大した安定性を有するものであることに基づいて選択されるものであってよいが、その様に選択されたＧＰＣＲ変異体を更に試験して、完全なアゴニストに結合するか（又は親ＧＰＣＲよりも弱く完全なアゴニストに結合するか）否かを測定する。完全なアゴニストに結合しない（又は結合が低減する）変異体が選択される。このように、１つの特定の立体構造に固定化されているＧＰＣＲを更に選択する。]
[0088] 選択されたリガンド（本発明の方法の工程（ｂ）で選択したもの）及び上述の更なる（第二の）リガンドが、リガンドの種類の任意のペア、例えば、完全なアゴニストとアンタゴニスト；アンタゴニストと逆アゴニスト；逆アゴニストとアンタゴニスト；逆アゴニストと完全なアゴニスト；及び完全なアゴニストと逆アゴニストなどであってよい。]
[0089] 前記受容体変異体が、更なる（第二の）リガンドに対する親受容体の親和性の５０％未満の親和性、より好ましくは１０％未満、更に好ましくは１％未満又は０．１％未満又は０．０１％未満の親和性で更なる（第二の）リガンドに結合することが好ましい。かくして、前記受容体変異体と第二のリガンドとの相互作用のＫｄは、親受容体よりも高い。実施例１に示すように、βアドレナリン受容体変異体であるβＡＲ−ｍ２３（アンタゴニストを使用して当該選択方法によって選択される）は、その親よりも３桁弱くアゴニストに結合する（すなわち、Ｋｄが１０００倍以上）。同様に、実施例２では、アデノシンＡ２ａ受容体変異体であるＲａｎｔ２１が、親よりも２から４桁弱くアゴニストに結合する。]
[0090] このタイプの対抗選択を使用して、より特異的（及び、そのため、より迅速且つより効率的）に変異誘発法を、リガンドによって決まる純粋な立体構造に対する経路に沿って管理することが可能であるため有用である。]
[0091] 好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、構造の完全性を維持している適切な可溶化形態で提供され、機能的形態である（例えば、リガンドに結合することが可能である）。特定のタンパク質について有効な当業者に選択されてよい適当な可溶化系、例えば、適切な界面活性剤（又は他の両親媒性剤）及び緩衝液系を使用する。典型的には、使用してよい界面活性剤は、例えば、ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）又はＣＨＡＰＳ又はオクチルグルコシド（ＯＧ）又は他の多数の界面活性剤を含む。コレステロールヘミスクシネート若しくはコレステロール自体又はヘプタン−１，２，３−トリオールなどの他の化合物を含めることも好都合であってよい。グリセロール又はプロリン又はベタインの存在は有用であってよい。ＧＰＣＲは、一度膜から可溶化されると、アッセイするために十分に安定である必要があることは重要である。幾つかのＧＰＣＲについては、ＤＤＭは十分であるが、望ましい場合には、グリセロール又は他のポリオールを添加して、アッセイのための安定性を増大させてよい。さらなるアッセイのための安定性は、任意にグリセロールの存在下において、例えば、ＤＤＭ、ＣＨＡＰＳ、及びコレステロールヘミスクシネートの混合物に可溶化することによって達成されてよい。特に不安定なＧＰＣＲについては、ジギトニン又はアンフィポール（amphipol）或いは従来の界面活性剤の非存在下において膜から直接ＧＰＣＲを可溶化することが可能であり、顕著な数の脂質をＧＰＣＲに結合させた状態のままとすることによって典型的に安定性を維持する他のポリマーを使用して可溶することが望ましい。機能的な形態の非常に不安定な膜タンパク質を可溶化するために、ナノディスク（nanodisc）を使用してもよい。]
[0092] 典型的には、ＧＰＣＲ変異体は、（例えば、大腸菌などの前記変異体を発現させた宿主細胞由来の膜画分の）粗抽出物で提供される。タンパク質変異体が、典型的には少なくとも７５％、より典型的には少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％のサンプル中に存在するタンパク質を占める形態で提供されてよい。言うまでもなく、典型的には、上述のように可溶化され、多くの場合にＧＰＣＲ変異体は界面活性剤及び／又は脂質分子と相互作用する。]
[0093] 任意の変性又は変性条件に対して、例えば、熱、界面活性剤、カオトロピック剤、又は極端なｐＨのいずれか１つ又は複数に対して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体が選択される。]
[0094] 熱に対する安定性（すなわち、熱安定性）に関して、これは、リガンド結合を測定することによって、或いは特定の温度における蛍光、ＣＤ、又は光散乱などの分光学的方法によって容易に測定することが可能である。典型的には、ＧＰＣＲがリガンドに結合する際は、特定の温度においてリガンドに結合するＧＰＣＲの能力を使用して、前記変異体の熱安定性を測定してよい。「見かけのＴｍ」、すなわち、５０％の受容体が所定の条件下で所定の時間（例えば、３０分）に亘ってインキュベートした後に、不活化される温度を測定することも好都合であり得る。より高い熱安定性のＧＰＣＲ変異体は、それらの親と比較してより大きな見かけのＴｍを有する。]
[0095] 界面活性剤又はカオトロピックに対する増大した安定性に関しては、典型的には、前記ＧＰＣＲを、試験界面活性剤又は試験カオトロピック剤の存在下において所定の時間に亘ってインキュベートして、例えば、リガンド結合又は上述の分光学的方法を使用して安定性を測定する。]
[0096] 極端なｐＨに関しては、典型的な試験ｐＨは、例えば、４．５から５．５（低ｐＨ）の範囲又は８．５から９．５（高ｐＨ）の範囲で選択されるであろう。]
[0097] 比較的強力な界面活性剤を結晶化の段階で使用するため、ＧＰＣＲ変異体がその様な界面活性剤の存在下において安定であることが好ましい。ある界面活性剤の「強力」さは、ＤＤＭ、Ｃ１１→Ｃ１０→Ｃ９ →Ｃ８マルトシド又はグルコシド、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＤＡＯ）及びＳＤＳの順である。ＧＰＣＲ変異体がＣ９マルトシド又はグルコシド、Ｃ８マルトシド又はグルコシド、ＬＤＡＯ、及びＳＤＳのいずれかに対して良い安定であることが特に好ましく、そのため、これらの界面活性剤を安定性試験に使用することが好ましい。]
[0098] 測定の容易性のため、熱安定性を測定することが好ましく、所定の条件に関して親タンパク質と比較して増大した熱安定性を有する変異体を選択する。熱は変性剤としての作用を有し、サンプルを冷却すること、例えば、氷上に置くことで容易に取り除くことが可能であると解されるであろう。熱安定性は、他の変性剤又は変性条件に対する安定性の指針でもある可能性がある。かくして、増大した熱安定性は、変性界面活性剤、特にＤＤＭよりも変成作用が強いもの、例えば、より小さな頭部基及びより短いアルキル鎖並びに／又は荷電した頭部基を有する界面活性剤中の安定性に置き換えられる可能性がある。本発明者は、熱安定性を有するＧＰＣＲが強力な界面活性剤に対してもより安定であることを発見した。]
[0099] 変性条件として極端なｐＨを使用する際は、中和剤を添加することによって迅速にこれを取り除くことができると解されるであろう。同様に、カオトロピック剤を変性剤として使用する際は、カオトロピック剤がカオトロピック効果を奏する濃度未満にサンプルを希釈することによって、変性効果を除去し得る。]
[0100] 当該選択方法の特定実施態様では、ＧＰＣＲはβ−アドレナリン受容体（例えば、シチメンチョウ由来）であり、リガンドは、アンタゴニストであるジヒドロアルプレノロール（ＤＨＡ）である。]
[0101] 当該選択方法の更なる好ましい実施態様では、ＧＰＣＲがアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）（例えば、ヒト由来）であり、リガンドが、アンタゴニストであるＺＭ２４１３８５（４−［２−［［７−アミノ−２−（２−フリル）［１，２，４］−トリアゾロ［２，３−α］［１，３，５］トリアジン−５−イル］アミノ］エチル］フェノール）又はアゴニストであるＮＥＣＡ（５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン）である。]
[0102] 当該選択方法のさらに好ましい実施態様では、ＧＰＣＲはニューロテンシン受容体（ＮＴＲ）（例えば、ラット由来）であり、リガンドが、アゴニストであるニューロテンシンである。]
[0103] 方法２

上記のように選択したＧＰＣＲ変異体を調製するための方法は、
（ａ）上述したＧＰＣＲ変異体を選択する方法を実施する工程、
（ｂ）増大した安定性について選択された１つ又は複数のＧＰＣＲ変異体中の１つ又は複数の変異したアミノ酸残基の位置を同定する工程、及び
（ｃ）同定した位置の１つ又は複数に変異を含むＧＰＣＲ変異体を合成する工程
を含む。]
[0104] 実施例において認められるように、驚くべきことに、ＧＰＣＲの内部の単独のアミノ酸に対する変化が、前記タンパク質が特定の立体構造を備える条件下おいて、親タンパク質と比較して前記タンパク質の安定性を増大させる。かくして、本発明の第二の態様に係る方法の第一の実施態様では、親タンパク質の１つのアミノ酸残基がタンパク質変異体では変化している。典型的には、前記アミノ酸残基は、本発明の第一の態様に係る方法において試験した変異体において認められるアミノ酸残基に変化される。しかしながら、任意の他のアミノ酸残基、例えば、任意の天然アミノ酸残基（特に、「コード可能な」アミノ酸残基）又は非天然アミノ酸に置き換えられてよい。一般的には、簡便にするために、アミノ酸残基は、１９の他のコード可能なアミノ酸の１つに置き換えられる。好ましくは、上述の選択方法において選択した変異体に存在する置き換えられたアミノ酸残基である。]
[0105] 実施例で認められるように、安定性における更なる増大が、親タンパク質のアミノ酸の２つ以上を置き換えることによって得られてよい。典型的には、置き換えられたアミノ酸の各々が、上述の選択方法を使用して同定されたものである。典型的には、同定された各アミノ酸は、タンパク質変異体に存在するアミノ酸に置き換えられてよいが、上述のように、それは任意の他のアミノ酸で置き換えられてもよい。]
[0106] 典型的には、ＧＰＣＲ変異体は、親タンパク質と比較して、１から１０の置き換えられたアミノ酸、好ましくは１から８、典型的には２から６、例えば、２、３、４、５、又は６の置き換えられたアミノ酸を含む。]
[0107] 多数の変異体が、本発明の第一の態様に係る選択方法に供されてよいと解されるであろう。換言すると、多数の変異体が当該選択の工程（ａ）で提供されてよい。その立体構造が非常に安定な多重点変異タンパク質を作製するために選択された、多数の変異誘発されたＧＰＣＲが作製されてよいと解されるであろう。]
[0108] ＧＰＣＲ変異体は任意の適切な方法によって調製されてよい。好都合には、前記タンパク質変異体は、適切な核酸分子にコードされ、適切な宿主細胞において発現される。前記ＧＰＣＲ変異体をコードする適切な核酸分子は、当該技術分野でよく知られている標準的なクローニング技術、部位特異的突然変異誘発法、及びＰＣＲを用いて作製されてよい。適切な発現系は、細菌又は酵母における構成的又は誘導性の発現系、バキュロウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、及びレンチウイルスなどのウイルス発現系、又は昆虫若しくは哺乳動物細胞における一過性トランスフェクションを含む。適切な宿主細胞は、大腸菌、乳酸連鎖球菌、サッカロミセスセレビシアエ、スキゾサッカロミセスポンベ、ピチアパストリス、スポドプテラフルギペルダ、及びトリコプルシアニ細胞を含む。適切な動物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、及びＤＴ４０などを含む。幾つかのＧＰＣＲは、機能するために特定の脂質（例えば、コレステロール）を必要とする。その場合には、脂質を含む宿主細胞を選択することが望ましい。加えて又は代替的に、前記脂質は、前記タンパク質変異体の単離及び精製の間に添加してもよい。これらの発現系及び宿主細胞は、当該選択方法の工程（ａ）におけるＧＰＣＲ変異体について使用してもよいと解されるであろう。]
[0109] 遺伝子及びｃＤＮＡのクローニング及び操作のため、ＤＮＡを変異させるため、及び宿
主細胞においてポリヌクレオチドからポリペプチドを発現させるための分子生物学的方法が、参照によって本明細書に取り込む「Molecular cloning, a laboratory manual”, third edition, Sambrook, J. &Russell, D.W. (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 」に例示されているように、当該技術分野においてよく知られている。]
[0110] 本発明の第一又は第二の態様の更なる実施態様では、選択又は調製したＧＰＣＲ変異体がＧタンパク質に結合することが可能であるか否かを測定してもよいと解される。前記選択又は調製したＧＰＣＲ変異体が、親ＧＰＣＲと同程度の広がり及び／又は親和性の順位で、選択したリガンドと同じ分類の複数のリガンドに結合することが可能であるか否かを測定することも好ましい。]
[0111] 方法３
実施例１から３に示し、且つ上述したように、熱安定化変異は、シチメンチョウβ１アドレナリン受容体、ヒトアデノシン受容体、ラットニューロテンシン受容体、及びヒトムスカリン受容体の配列全体に広く分布する。図１７は、ヒトβ−２ＡＲの配列を有するこれらの配列のアラインメントを提供し、熱安定化変異が前記配列に位置する際に、全部で７０のうち１１例において、２つの配列が同じ位置に変異を含有している（図１７において星印で示す）。かくして、１つ又は複数の安定化変異が１つのＧＰＣＲで同定されると、増大した安定性を有する更なるＧＰＣＲを、ＧＰＣＲのアミノ酸配列アラインメント及び対応する１つ又は複数の位置で１つ又は複数の変異を作製することによって産生されてよい。この概念は、シチメンチョウβ１−ｍ２３の６つの熱安定化変異がヒトβ２受容体に直接転用した図２６に明確に例示されている。結果として得られた変異体であるβ２−ｍ２３は、ヒトβ２受容体よりも１２℃高いＴｍを有していた。] 図２６
[0112] 従って、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を製造するための更なる方法は、
（ｉ）第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異のアミノ酸配列において、１つ又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、１つ又は複数の位置を同定する工程、及び
（ｉｉ）対応する１つ又は複数の位置において、第二のＧＰＣＲを規定するアミノ酸配列に１つ又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程
を含む。]
[0113] 第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体は、上述した選択又は調製方法に従って選択又は調製されてよい。したがって、この方法を、変異誘発により安定で立体構造が固定されたＧＰＣＲを作製するために使用してもよい。例えば、特定の立体構造における増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体の選択の後に、安定化変異を同定し、第二のＧＰＣＲの対応する位置のアミノ酸が置き換えられ、第二の親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造において増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を製造することが可能である。]
[0114] 誤解を避けるために言及すると、第一の親ＧＰＣＲは、天然の配列を有するＧＰＣＲであってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。]
[0115] 典型的には、１つ又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、１つ又は複数の位置を同定することは、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）を使用して、それらのアミノ酸配列を親ＧＰＣＲの配列とアラインメントすることを伴う。]
[0116] 「対応する１つ又は複数の位置」によって、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗを使用して、第一の及び第二のＧＰＣＲがアラインメントによって比較される際に、第一のＧＰＣＲのアミノ酸配列における位置に整列（アライン）する第二のＧＰＣＲのアミノ酸配列における位置を含む。例えば、図１７におけるアラインメントで示すように、シチメンチョウβ１−ｍ２３における６つの安定化変異であるR68S, M90V, Y227A,A282L, F327A 、及びF338Mが、ヒトβ２受容体における残基であるK60, M82, Y219, C265, L310 、及びF321の各々に対応する位置である。]
[0117] 第二のＧＰＣＲのアミノ酸配列における対応する１つ又は複数の位置を同定して、それらの位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置き換える。典型的には、前記アミノ酸は、第一の親ＧＰＣＲの変異体における対応する位置のアミノ酸を置き換えたものと同じアミノ酸で置き換えられる（但し、それらのアミノ酸が既にその残基に存在する場合を除く）。例えば、シチメンチョウβ１−ｍ２３の６８位では（Ｒ６８Ｓ）、アルギニン残基がセリン残基で置き換えられている。したがって、ヒトβ２受容体の対応する位置である６０位（Ｋ６０）において、リジン残基が好ましくはセリン残基で置き換えられる。]
[0118] 変異は、例えば、上述のように、且つ、当該技術分野においてよく確立された技術を使用して、アミノ酸配列において作製されてよい。]
[0119] 第二のＧＰＣＲは任意の他のＧＰＣＲであってよいと解されるであろう。例えば、１つの種に由来するＧＰＣＲにおける安定化変異は、他の種に由来する第二のＧＰＣＲに転用してよい。同様に、１つの特定のＧＰＣＲアイソフォームにおける安定化変異は、異なるアイソフォームである第二のＧＰＣＲに転用してよい。好ましくは、第二の親ＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲの分類又はファミリーのものである。系統発生解析は、タンパク質配列の類似性に基づいて、ＧＰＣＲを３つの主な分類、すなわち、クラス１、２、及び３に分けており、それらのフェノタイプはロドプシン、セレクチンレセプター、及びメタボトロピックグルタメート受容体の各々である（Foord et al (2005)Pharmacol. Rev. 57, 279-288）。かくして、第二のＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲの分類のＧＰＣＲであってよい。同様に、ＧＰＣＲは、グルタメート及びＧＡＢＡなどの天然のリガンドによってファミリーに分類されている。かくして、第二のＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲファミリーのものであってよい。ＧＰＣＲの分類及びファミリーの一覧は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288）によって作成されており、その一覧はhttp://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardで定期的に更新されている。]
[0120] 第二の親ＧＰＣＲは、第一のＧＰＣＲにおける変異の対応する位置を第二のＧＰＣＲにおいて決定し得るように、第一の親ＧＰＣＲと整列（アライン）することが可能でなくてはならないと解されるであろう。かくして、典型的には、第二の親ＧＰＣＲは、前記第一の親ＧＰＣＲに対して少なくとも２０％の配列同一性を有し、より好ましくは第一の親ＧＰＣＲに対して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の配列同一性を有する。しかしながら、幾つかのＧＰＣＲは、低い配列同一性を有しており（例えば、ファミリーＢ及びＣのＧＰＣＲ）、同時に構造においては非常に似ている。かくして、２０％の配列同一性のしきい値は絶対的なものではない。]
[0121] 方法４

本発明者は、増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体における１つ又は複数の変異が存在する構造モチーフの同定が、増大した安定性を有する更なるＧＰＣＲ変異体を製造するのに有用であろうと考えた。]
[0122] したがって、親Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を製造するための更なる方法は、
ａ．第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、
ｂ．１つ又は複数の変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、１つ又は複数の構造モチーフを構造膜タンパク質モデルにおいて同定する工程、及び
ｃ．第二の親ＧＰＣＲにおける１つ又は複数の対応する構造モチーフを規定するアミノ酸配列における１つ又は複数の変異を作製し、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異を提供する工程
を含む。]
[0123] １つ又は複数の既知の構造モデルにおいて安定化変異をマッピングすることを使用して、その様な安定化変異を有する特定の構造モチーフを同定してよい。本発明者は、その様なモチーフを同定するために、β２−アドレナリン受容体の構造モデルに対してβ１アドレナリン受容体の安定化変異をマッピングした（Rasmussen et al (2007) Nature 450, 383-387; Cherezov et al (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al (2007) Science 318:1266-1273）。例えば、表（ｖｉ）は、本発明者がヒトβ２−アドレナリン受容体に対してマッピングしたシチメンチョウβ１−アドレナリン受容体変異体を挙げており、それらが存在する対応する構造モチーフを記載している。実施例４に記載のように、Ｙ２２７Ａ変異（ヒトβ２受容体のＹ２１９に対応する）のヒトβ２アドレナリン受容体に対するマッピングは、変異がヘリックス界面におけるパッキングを改善し得るように、ヘリックス間の界面に位置することを明らかにする（実施例１５、１６、及び２３参照）。同様に、Ｍ９０Ｖ変異（ヒトβ２受容体におけるＭ８２に対応する）のヒトβ２−受容体に対するマッピングは、ヘリックスが折れ曲がる（キンク）部分でヘリックス２に変異が存在することを明らかにする（図１５、１６、及び２０参照）。他の変異は、脂質二重膜、疎水性−親水性境界領域、タンパク質結合ポケット、及びループ領域に向いている膜貫通ヘリックス表面を含む更なる構造モチーフに存在することが認められた（表（ｖｉ）及び図１８−１９、２１−２２、及び２４−２５）。] 図１５ 図１８
[0124] その様な構造モチーフは、安定化変異を含有することによって、タンパク質の安定性の決定に重要である。したがって、これらのモチーフを変異の標的とすることは、安定化ＧＰＣＲ変異体の産生を容易にするであろう。事実、同じ構造モチーフに２以上の変異がマップされた複数の例が存在する。例えば、シチメンチョウβ１アドレナリン受容体Y２２７Ａ、Ｖ２３０Ａ、及びＡ２３４Ｌ変異は、同じヘリックス界面にマップされ、Ｖ８９Ｌ及びＭ９０Ｖ変異は同じヘリックスの折れ曲がり（キンク）にマップされ、Ｆ３２７Ａ及びＡ３３４Ｌ変異は脂質二重膜に向いた同じヘリックス表面にマッピングされた（表（ｖｉ））。かくして、１つの安定化変異が同定された際は、変異が存在する構造モチーフの決定は、更なる安定化変異の同定を可能にするであろう。]
[0125] 第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体は、上述した方法の任意のものに従って選択又は調製されてよい。したがって、この方法を、変異誘発により安定で立体構造が固定されたＧＰＣＲを作製するために使用してもよい。例えば、特定の立体構造における増大された安定性を有するＧＰＣＲ変異体の選択の後に、その様な安定化変異が存在する構造モチーフを同定してよい。他のＧＰＣＲにおいて、対応する構造モチーフを規定するアミノ酸配列における１つ又は複数の変異を作製することが、次いで、親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造において増大された安定性を有するＧＰＣＲ変異体を製造するために使用されてよい。]
[0126] 本発明者は、ヒトβー２ＡＲ、ラットＮＴＲ１、シチメンチョウβ−１ＡＲ、ヒトアデノシンＡ２ａＲ、及びヒトムスカリンＭ１受容体のアミノ酸配列（図１７）の多重配列アラインメントを実施し、同定された熱安定化変異（実施例１から３）が前記配列に存在する際は、全部で７０のうち１１例において、２つの配列が同じ位置で変異を有していることが示されている（図１７において星印で示す）。いずれかの理論につなげることを意図しないが、本発明者は、これらの位置の熱安定化変異は、構造膜タンパク質モデルにマッピングするための促進された転用可能性を有するものであるはずである。かくして、１つの実施態様では、第一の親ＧＰＣＲの変異体は、対応する親受容体と比較した際に、図１７に記載のヒトβ２ＡＲの番号付けした以下の位置：Ala 59, Val 81, Ser 143, Lys147, Val 152, Glu 180, Val 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 及びVal 317の任意の１つ又は複数に対応する位置で異なるアミノ酸を有する、ヒトβ−２ＡＲ、ラットＮＴＲ１、シチメンチョウβ−１ＡＲ、ヒトアデノシンＡ２ａＲ、又はヒトムスカリンＭ１受容体である。]
[0127] １つ又は複数の構造モチーフを同定するために、安定化変異を膜タンパク質の既知の構造にマッピングする。]
[0128] 「膜タンパク質」によって、細胞又はオルガネラの膜に結合又は接合するタンパク質を意味する。好ましくは、前記膜タンパク質は、膜に持続的に組み込まれ、脂質二重層を物理的に破壊する界面活性剤、非極性溶媒、又は変性剤を用いてのみ除去され得る内在性膜タンパク質である。]
[0129] 膜タンパク質の構造モデルは任意の適切な構造モデルであってよい。例えば、前記モデルは、既知の結晶構造であってよい。ＧＰＣＲ結晶構造の例は、ウシロドプシン（Palczewski, K. et al., Science289, 739-745. (2000)）及びヒトβ２アドレナリン受容体（Rasmussen et al, Nature 450, 383-7 (2007); Cherezov et al (2007) Science 318:1258-65; Rosenbaum et al (2007) Science 318:1266-1273）を含む。ヒトβ２アドレナリン受容体構造の座標は、RCSB Protein Data Bankにおいて2rh1, 2r4r 及び2r4sの登録番号で認められる。代替的には、構造モデルは、ホモロジーに基づくか又はｄｅ ｎｏｖｏ構造予測法を使用して、コンピューターによって生成されるモデルであってよい（Qian et al Nature (2007) 450: 259-64）。]
[0130] 所定のＧＰＣＲ変異体の安定化変異は、ＧＰＣＲに対して十分な構造類似性を有する任意の膜タンパク質の構造モデルにマッピングされてよい。特に、膜タンパク質のドメインは、転用可能な所定の変異について、安定化変異が存在するＧＰＣＲドメインに対して十分な構造類似性を有する。]
[0131] タンパク質ドメインは、典型的には、単独のタンパク質として単独で存在するか又は他のドメインとの組み合わせにおける大きなタンパク質の一部であってよい二次構造要素の個別的に折りたたまれた集合として規定される。一般的には、機能的な進化単位である。]
[0132] ＧＰＣＲは本質的には大きなＮ末端ドメインを有するものを除く単独のドメインタンパク質である。したがって、典型的には、その構造モデルは、ＧＰＣＲに対して十分な類似性を有する少なくとも１つのドメインを含む膜タンパク質のものである。]
[0133] 構造類似性は、配列同一性の分析によって間接的に又は構造の比較によって直接的に決定されてよい。]
[0134] 配列同一性に関しては、変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有するＧＰＣＲドメインをコードするアミノ酸配列を、構造モデルが利用可能な膜タンパク質のドメインをコードするアミノ酸配列と整列（アライン）する。これらの配列の１つ又は複数は、主要保存ドメインに加えて、挿入配列又はＮ末端若しくはＣ末端伸長を含有してよい。最適なアラインメントのために、その様な配列は、分析を歪めないように除外する。問題のドメインに亘る十分な配列同一性を有する膜タンパク質を、次いで、変異をマッピングするための構造モデルとして使用してよい。可溶性タンパク質ドメインについては、それらの３Ｄ構造は、配列同一性が増大すると１００％まで増大する構造保存のレベルとともに、約２０％の配列同一性で広範に保存されており、良好には３０％超の同一性で保存されていることが示されている（Ginalski,K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177）。かくして、構造膜タンパク質モデルが、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を含有するＧＰＣＲドメイン変異体と少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％又は９９％の配列同一性を共有するドメインを含有する膜タンパク質のモデルである。]
[0135] 配列同一性は、ＢＬＡＳＴ又はＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Altschul et al, NAR (1997), 25, 3389-3402）などのアルゴリズム又はHidden Markov Models (Eddy S et al, J Comput Biol (1995) Spring 2 (1)9-23)に基づく方法を使用して測定してよい。典型的には、２つのポリペプチドの間の配列同一性の％は、任意の適切なコンピュータープログラム、例えば、University of Wisconsin Genetic Computing GroupのＧＡＰプログラムを使用して測定してよく、配列が最適に整列（アライン）されたポリペプチドに関して同一性の％を計算すると解されるであろう。そのアラインメントは、代替的には、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して実施されてよい（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。使用するパラメータは、以下：Fast pairwise alignment parameters: K-tuple(word) size; 1, window size; 5, gap penalty; 3, number of top diagonals; 5. Scoring method: x percent. Multiple alignment parameters: gap open penalty; 10, gap extension penalty; 0.05. Scoring matrix: BLOSUMのものであってよい。]
[0136] 配列同一性に加えて、構造類似性が、構造モデルの比較によって直接的に決定されてよい。構造モデルを使用して、配列中で連続的であるか又はそうでなくてよい、配列分析のみからは明らかでない構造類似領域を検出してよい。例えば、ファミリーＢ及びＣのＧＰＣＲは類似した構造を共有すると解されているが、それらの配列同一性は非常に低い。同様に、水輸送アクアポリンであるホウレンソウＳｏＰｉｐ２、大腸菌ＡｑｐＺ、メタノコッカスＡｑｐＭ、ラットＡｑｐ４、ヒトＡｑｐ１、及びヒツジＡｑｐ０は、低い配列同一性を共有しているが、それら全ては類似した構造を有する。]
[0137] 高い忠実性の構造モデルが、構造が相同的なタンパク質の既知の構造に基づいてモデルを作製するＭＯＤＥＬＬＥＲ（Sali A and Blundell T, J Mol Biol (1993) 234(3) 779-815 ）などの標準的なソフトウェアパッケージを使用して未知の構造のタンパク質について作製されてよい。その様なモデリングは、配列同一性の増大とともに改善する。典型的には、未知の構造の配列と既知の３Ｄ構造の配列との間の配列同一性は、３０％超である（Ginalski,K. Curr Op Struc Biol (2006) 16, 172-177）。加えて、配列のみに基づくｄｅ ｎｏｖｏ構造予測法を使用して、未知の構造のタンパク質のモデルを作製してよい（Qian et al, (2007) Nature 450:259-64）。構造を実験的に測定又はモデリングによって導き出すと、構造類似領域が、２以上の３Ｄ構造の直接的な比較によって検出されてよい。それらは、例えば、ＤＡＬＩ（Holm, L and Sander, C (1996) Science 273, 595-603）などのソフトウェアを使用して検出可能な特定の構造及びトポロジーといった二次的な構造要素を含んでよい。それらは、アミノ酸側鎖及びポリペプチド主鎖の局所的な配列、特定の空間配置における原子の特定のセット若しくは原子のグループを含んでよく、例えば、グラフ理論的表現を使用して検出されてもよい(Artymiuk,P et al, (2005) J AmerSoc Info Sci Tech 56 (5) 518-528)。この手法において、比較するタンパク質又はタンパク質の領域内の原子又は原子のグループが、典型的には、ノードの間の角度及び間隔を表示するグラフのエッジとともにグラフのノードとして表わされる。これらのグラフにおける共通のパターンは、共通の構造モチーフを示す。この手法が拡張されて、水素結合ドナー若しくはアクセプター、疎水性、形状、電荷、又は芳香性などの原子又は原子のグループの任意の記述子を含んでよく、例えば、ＧＲＩＤ及び類似性調査のための基礎として使用される当該表示を使用して、その様な記述子にしたがってタンパク質が空間的にマッピングされてよい。前記方法、ソフトウェアの利用可能性、及び使用者の規定するパラメータ、しきい値、及び許容値の選択のためのガイドラインの説明は上述の参考文献に記載している。]
[0138] 好ましい実施態様では、構造膜タンパク質モデルは構造ＧＰＣＲモデルである。ＧＰＣＲの構造モデルは、第一の親ＧＰＣＲのモデルであってよいと解されるであろう。例えば、増大された安定性を有するＧＰＣＲ変異体内の安定化変異は、第一の親ＧＰＣＲ構造及びその様な変異が存在する構造モチーフに直接マッピングされてよい。第一の親ＧＰＣＲの構造が未知である場合は、他のＧＰＣＲの構造モデルを使用してよい。例えば、１つの種に由来するＧＰＣＲの安定化変異は、他の種に由来する同じＧＰＣＲの既知の構造モデルにマッピングされてよい。同様に、１つの特定のＧＰＣＲアイソフォームにおける安定化変異は、他のＧＰＣＲアイソフォームの既知の構造モデルにマッピングされてよい。さらに、１つのＧＰＣＲに由来する安定化変異は、同じ分類又はファミリーの他のＧＰＣＲにマッピングしてよい。ＧＰＣＲの分類及びファミリーの一覧は、International Unionof Pharmacology (Foord et al (2005) Pharmacol. Rev. 57, 279-288) によって作成されており、当該一覧は、http://www.iuphar-db.org/GPCR/ReceptorFamiliesForwardで定期的に更新されている。]
[0139] 上述のように、構造モデルが、ＧＰＣＲ変異体が第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸を有するドメインに亘って十分な構造類似性を有する任意のＧＰＣＲのものであってよいと解されるであろう。かくして、ＧＰＣＲが、第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を含有するタンパク質ドメインに亘って、第一の親ＧＰＣＲの変異体と少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％又は９９％の配列同一性を共有することが好ましい。しかしながら、発明者は、２０％の配列同一性のしきい値は絶対的なものではないと認識している。第一の親ＧＰＣＲに対して２０％未満の配列同一性を有するＧＰＣＲは、低い配列同一性が他の類似性、例えば、第一の親ＧＰＣＲと比較して同じ配列モチーフの存在、同じG−タンパク質に対する結合、又は同じ機能を有すること、或いは同じ疎水性親水性指標のプロットを有することによって相殺される場合に、安定化変異が転用される構造モデルとしても役に立ち得る。]
[0140] 構造モデルに対する安定化変異のマッピングは、当該技術分野において既知の適切な任意の方法を使用して実施されてよい。例えば、典型的には、構造モデルが利用可能なＧＰＣＲのアミノ酸配列を、第一の親ＧＰＣＲの変異体のアミノ酸配列と整列（アライン）する。第一の親ＧＰＣＲと関係する、ＧＰＣＲ変異体の少なくとも１つの異なるアミノ酸残基の１つ又は複数の位置は、構造モデルが利用可能なＧＰＣＲのアミノ酸配列に存在してよい。]
[0141] 「構造モチーフ」によって、熱安定化変異のＧＰＣＲ構造モデルにおける位置の三次元的記載を含める。例えば、構造モチーフは、ＧＰＣＲの内部の任意の二次又は三次構造モチーフであってよい。「三次構造モチーフ」によって、水素結合ドナー若しくはアクセプター、疎水性、形状、電荷、又は芳香性などの原子又は原子のグループの任意の記述子を含める。例えば、タンパク質は、ＧＲＩＤ及び構造モチーフを規定するための基礎として使用される当該表示を使用してその様な記述子にしたがって空間的にマッピングされてよい（Baroni et al (2007) J Chem Inf Mod 47, 279-294）。]
[0142] 表（ｖｉ）は、安定化変異が存在することが認められるシチメンチョウβ１アドレナリン受容体の構造モチーフを挙げている。表から認められるように、変異は多数の異なる位置に存在している。３つの変異が、水性溶媒に接近可能であることが予測されるループ領域に存在する。８つの変異が、膜貫通α−ヘリックスに存在し、脂質二重層に向いており；これらの変異のうち３つが、ヘリックスの末端近辺であり、疎水性−親水性境界層にあると解されてよい。８つの変異は、膜貫通α−ヘリックスの間にあり、そのうち３つはヘリックスの折れ曲げられた（キンクされた）又は歪められた領域のいずれかに存在し、他の２つの変異は１つのヘリックスに存在するが、変異残基に対する空間に近接した折れ曲がり（キンク）を含む１つ又は複数の他のヘリックスと近接していると認められる。これらの後者の変異は、折れ曲がり（キンク）領域内のアミノ酸のパッキングに作用し、熱安定性を生じさせ得る。他の変異は基質結合ポケットに存在する。]
[0143] したがって、１つの実施態様では、構造モチーフは、ヘリックス界面、ヘリックス折れ曲がり（キンク）、ヘリックス折れ曲がり（キンク）の逆のヘリックス、脂質二重層に向いたヘリックス表面、疎水性−親水性境界層における脂質二重層に向いたヘリックス表面、ループ領域、又はタンパク質結合ポケットのいずれかである。]
[0144] 安定化変異が存在する構造モチーフの同定は、タンパク質安定性におけるモチーフの重要性を示唆する。したがって、対応する１つ又は複数の構造モチーフを規定するアミノ酸配列における１つ又は複数の変異の作製は、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供するはずである。]
[0145] 構造モチーフを規定するアミノ酸配列は、タンパク質の二次又は三次構造において結合して構造モチーフを形成する、アミノ酸残基の一次アミノ酸配列である。その様な一次アミノ酸配列が連続的又は非連続的なアミノ酸残基を含んでよいと解されるであろう。かくして、構造モチーフを規定するアミノ酸配列の同定は、関与する残基を決定し、配列を実質的に規定することを伴うであろう。変異は、例えば、上述のように、当該技術分野においてよく確立された技術を使用して、アミノ酸配列において作製されてよい。]
[0146] 「対応する１つ又は複数の構造モチーフ」によって、第二の親ＧＰＣＲに存在する構造モデルにおいて同定される一つ又は複数の類似構造モチーフを意味する。例えば、ヘリックス界面を同定する場合には、第二の親ＧＰＣＲにおける対応するヘリックス界面は、構造モデルに存在するヘリックスに類似するヘリックスの間の界面であろう。ヘリックスの折れ曲がり（キンク）を同定した場合には、対応するヘリックスの折れ曲がり（キンク）は、構造モデルに存在する折れ曲がった（キンク）ヘリックスに類似するヘリックスにおける折れ曲がり（キンク）であろう。第二の親ＧＰＣＲにおける１つ又は複数の類似する構造モチーフは、例えば配列アラインメントによって、構造モデルにおける１つ又は複数のモチーフを規定する第二の親ＧＰＣＲの配列中の類似のアミノ酸配列を検索することによって同定されてよい。さらに、コンピューターに基づくアルゴリズムは、当該技術分野において広く利用可能であり、アミノ酸配列に基づくタンパク質モチーフの存在の予測に使用されてよい。かくして、アミノ酸配列内の特定のモチーフの相対的な位置及び他のモチーフに関連する位置に基づいて、類似する構造モチーフが容易に同定されてよい。第二の親ＧＰＣＲの構造モデルが利用可能である場合に、類似する１つ又は複数の構造モチーフがタンパク質の構造に対して直接マッピングされてよいと解されるであろう。典型的には、類似する構造モチーフを規定するアミノ酸配列は、構造モデルにおいてモチーフを規定する配列と少なくとも２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、及び９０％、並びにさらに好ましくは９５％及び９９％の配列同一性を有する。]
[0147] １つの実施態様では、第二の親ＧＰＣＲは第一の親ＧＰＣＲである。誤解を避けるために言及すると、第二の親ＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲの天然の配列を有してよく、又は切断型であってよく、又は天然タンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。]
[0148] 代替的な態様において、第二の親ＧＰＣＲは、第一の親ＧＰＣＲではない。例えば、増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの変異体が同定されてよいが、増大した安定性を有する異なるＧＰＣＲの変異体を産生することが望ましい。好ましくは、第二の親ＧＰＣＲは、上述の第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲの分類又はファミリーのものである。しかしながら、第二の親ＧＰＣＲが任意の既知のＧＰＣＲであってよいが、第一の親ＧＰＣＲの変異体の安定化変異が存在する対応する構造モチーフを含有するように、第一の親ＧＰＣＲと顕著な構造類似性を共有すると解されるであろう。かくして、典型的には、第二の親ＧＰＣＲが、第一の親ＧＰＣＲと少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の配列同一性を有する。しかしながら、上述のように、幾つかのＧＰＣＲは、低い配列同一性を有するが（例えば、ファミリーＢ及びＣのＧＰＣＲ）、構造において類似する。かくして、２０％の配列同一性のしきい値は絶対的なものではない。]
[0149] 増大された安定性についてＧＰＣＲにおいてスクリーニングされ得る数千の変異体が潜在的に存在するため、安定性に対する寄与において重要であることが既知の特定の変異を標的とすることが有利である。したがって、方法３及び４は、増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択する方法において使用してよいと解されるであろう。特に、方法３及び４を実施して、安定性の決定に重要な構造モチーフを規定する特定のアミノ酸残基又はアミノ酸配列に対する変異を標的としてよい。]
[0150] したがって、１つの実施態様では、方法３及び４は、
（Ｉ）特定の立体構造を備えた第二の親ＧＰＣＲに結合するものであるリガンドを選択する工程、
（ＩＩ）第二の親ＧＰＣＲの変異体又はその各々が、特定の立体構造を備える際に、同じ特定の立体構造を備えている第二の親ＧＰＣＲのリガンド結合についての安定性と比較して、選択したリガンドの結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、及び
（ＩＩＩ）選択したリガンドの結合に関して第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程
をさらに含む。]
[0151] 工程（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）は、上述の方法１の工程（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）に対応することに留意されたい。したがって、リガンド及び安定性を評価する方法は、好ましくは方法１に関して上述しているものである。]
[0152] 親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する任意のＧＰＣＲ変異体、例えば、上述した方法１〜４のいずれかによって提供されるものを本発明において使用してよい。例えば、親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体、特に増大した熱安定性を有するものを使用してよい。本発明における使用に適したＧＰＣＲ変異体の特定例は以下で提供される。]
[0153] １つの実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体は、親受容体と比較して、以下の位置:（ｉ）図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けによる：Ｉｌｅ ５５，Ｇｌｙ ６７，Ａｒｇ ６８，Ｖａｌ ８９，Ｍｅｔ ９０，Ｇｌｙ ６７，Ａｌａ １８４，Ａｒｇ １９９，Ａｌａ ２０３，Ｌｅｕ ２０８，Ｇｌｎ ２１０，Ｓｅｒ ２１３，Ｇｌｕ ２１９，Ａｒｇ ２２０，Ｓｅｒ ２２３，Ｔｈｒ ２２４，Ｇｌｎ ２２６，Ｌｙｓ ２２７，Ｈｉｓ ２３０，Ｌｅｕ ２４１，Ｐｒｏ ２６０，Ｓｅｒ ２６３，Ｌｅｕ ２６７，Ｌｅｕ ２７２，Ｔｈｒ ２７９，Ａｓｎ ２８４，Ｇｌｎ ３１１，Ｐｒｏ ３１３，Ｌｙｓ ３１５、（ｉｉｉ）図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けによる：Ａｌａ ６９，Ｌｅｕ ７２，Ａｌａ ７３，Ａｌａ ８６，Ａｌａ ９０，Ｓｅｒ １００，Ｈｉｓ １０３，Ｓｅｒ １０８，Ｌｅｕ １０９，Ｌｅｕ １１１，Ａｓｐ １１３，Ｉｌｅ １１６，Ａｌａ １２０，Ａｓｐ １３９，Ｐｈｅ １４７，Ａｌａ １５５，Ｖａｌ １６５，Ｇｌｕ １６６，Ｌｙｓ １７６，Ａｌａ １７７，Ｔｈｒ １７９，Ｍｅｔ １８１，Ｓｅｒ １８２，Ａｒｇ １８３，Ｐｈｅ １８９，Ｌｅｕ ２０５，Ｔｈｒ ２０７，Ｇｌｙ ２０９，Ｇｌｙ ２１５，Ｖａｌ ２２９，Ｍｅｔ ２５０，Ｉｌｅ ２５３，Ｌｅｕ ２５６，Ｉｌｅ ２６０，Ａｓｎ ２６２，Ｖａｌ ２６８，Ａｓｎ ２７０，Ｔｈｒ ２７９，Ｍｅｔ ２９３，Ｔｈｒ ２９４，Ｇｌｙ ３０６，Ｌｅｕ ３０８，Ｖａｌ ３０９，Ｌｅｕ ３１０，Ｖａｌ ３１３，Ｐｈｅ ３４２，Ａｓｐ ３４５，Ｔｙｒ ３４９，Ｔｙｒ ３５１，Ａｌａ ３５６，Ｐｈｅ ３５８，Ｖａｌ ３６０，Ｓｅｒ ３６２，Ａｓｎ ３７０，Ｓｅｒ ３７３，Ｐｈｅ ３８０，Ａｌａ ３８５，Ｃｙｓ ３８６，Ｐｒｏ ３８９，Ｇｌｙ ３９０，Ｔｒｐ ３９１，Ａｒｇ ３９２，Ｈｉｓ ３９３，Ａｒｇ ３９５，Ｌｙｓ ３９７，Ｐｒｏ ３９９、及び（ｉｖ）図１７に記載のムスカリン受容体の番号付けによる：Ｌｅｕ ６５、Ｍｅｔ １４５、Ｌｅｕ ３９９、Ｉｌｅ ３８３及びＭｅｔ ３８４の任意の１つ又は複数に対応する位置に、少なくとも１つの異なるアミノ酸を有するＧＰＣＲ変異体である。]
[0154] 図１７に示すシチメンチョウβ１ＡＲ、ヒトアデノシン受容体、ラットニューロテンシン受容体、及びヒトムスカリン受容体アミノ酸配列のアラインメントは、７０のうちの１１例において、２つの配列が同じ位置、すなわち、図１７に記載のヒトβ２ＡＲの番号付けした以下の位置：Ala 59, Val 81, Ser 143, Lys 147, Val 152, Glu 180, Val 222, Ala 226, Ala 271, Leu 275 及びVal 317に変異を含有することを示す。従って、更なる実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体は、親受容体と比較して、これらの位置の任意の１つに異なるアミノ酸を有するものである。]
[0155] β−アドレナリン受容体変異体
β−アドレナリン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アドレナリンに結合する。]
[0156] １つの実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体は、対応する野生型のβ−アドレナリン受容体と比較した際に、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けによる以下の位置:Ｉｌｅ ５５，Ｇｌｙ ６７，Ａｒｇ ６８，Ｖａｌ ８９，Ｍｅｔ ９０，Ｇｌｙ ９８，Ｉｌｅ １２９，Ｓｅｒ １５１，Ｖａｌ １６０，Ｇｌｎ １９４，Ｇｌｙ １９７，Ｌｅｕ ２２１，Ｔｙｒ ２２７，Ａｒｇ ２２９，Ｖａｌ ２３０，Ａｌａ ２３４，Ａｌａ ２８２，Ａｓｐ ３２２，Ｐｈｅ ３２７，Ａｌａ ３３４，Ｐｈｅ ３３８の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、β−アドレナリン受容体変異体である。]
[0157] β−アドレナリン受容体変異体は、任意のβ−アドレナリン受容体変異体であってよいが、所定のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体アミノ酸配列に参照されるアミノ酸の位置の１つ又は複数において変異されている。]
[0158] ＧＰＣＲ変異体が、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷ（Thompson et al (1994) Nucl. AcidsRes. 22, 4673-4680）を使用して測定すると、前記所定のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体配列と比較した際に少なくとも２０％アミノ酸配列同一性を有する者であることが特に好ましい。より好ましくは、前記受容体変異体は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する。一般的に、より高い程度のアミノ酸同一性が、天然のリガンドが結合するオルトステリック（「活性」）部位の付近では保存されている。]
[0159] 以下の実施例１及び図１に記載のように、親シチメンチョウβ−アドレナリン配列（図９に示す）における以下のアミノ酸残基：Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151,Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, Phe 338の個々の置換は、熱安定性の増大を引き起こす。] 図１
[0160] かくして、親と比較した際に、これらのアミノ酸残基の１つ又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられているシチメンチョウβ−アドレナリン受容体変異体を使用してよい。親受容体における１つ又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基に置き換えられている、他の起源に由来するβ−アドレナリン受容体変異体も使用してよい。]
[0161] １つの実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有するβ−アドレナリン受容体変異体であり、前記受容体変異体は、親受容体と比較して、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けによる以下の位置:Ｉｌｅ ５５，Ｇｌｙ ６７，Ａｒｇ ６８，Ｖａｌ ８９，Ｍｅｔ ９０，Ｇｌｙ ９８，Ｉｌｅ １２９，Ｓｅｒ １５１，Ｖａｌ １６０，Ｇｌｎ １９４，Ｇｌｙ １９７，Ｌｅｕ ２２１，Ｔｙｒ ２２７，Ａｒｇ ２２９，Ｖａｌ ２３０，Ａｌａ ２３４，Ａｌａ ２８２，Ａｓｐ ３２２，Ｐｈｅ ３２７，Ａｌａ ３３４，Ｐｈｅ ３３８．のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する。]
[0162] 誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するβ−アドレナリン受容体であってよく、又はその切断型であってよく、又は天然のタンパク質又はその断片との融合体であってよく、又はリガンド結合能を保持している天然配列と比較して変異を含有してよい。]
[0163] 「対応するアミノ酸残基」によって、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体と他のβ−アドレナリン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較する際に、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体中の所定のアミノ酸残基に対して整列（アライン）する他のβ−アドレナリン受容体のアミノ酸残基が含まれる。]
[0164] 図９は、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体とヒトβ１、β２、及びβ３−アドレアなリン受容体との間のアラインメントを示す。]
[0165] ヒトβ１のＩｌｅ７２はシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＩｌｅ５５と対応し；ヒトβ２のＩｌｅ４７はシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＩｌｅ５５と対応し；ヒトβ３のＴｈｒ５１がシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のＩｌｅ５５と対応していることが認められる。ヒトβ１、β２、及びβ３における他の対応するアミノ酸残基は図９を参照して容易に同定することが可能である。]
[0166] 特定のアミノ酸がＡｌａに置き換えられることが好ましい。しかしながら、特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置きかえられることが好ましい（例えば、図１におけるシチメンチョウβ−アドレナリン受容体のAla 234、Ala 282、及びAla 334）。] 図１
[0167] さらに大きい安定性が与えられる可能性があるため、β−アドレナリン受容体は、２以上のアミノ酸の位置において、親と比較して異なるアミノ酸を有することが好ましい。特に好ましいヒトβ１受容体変異体は、以下のアミノ酸残基：K85, M107, Y244, A316, F361 及び F372の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する残基である場合を除く）。]
[0168] 上述の３又は４又は５又は６の変異の組み合わせを有するヒトβ１受容体変異体を調製する。]
[0169] 特に好ましいヒトβ２受容体変異体は、以下のアミノ酸：K60, M82, Y219, C265, L310及びF321の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。]
[0170] 上述の３又は４又は５又は６の変異の組み合わせを有するヒトβ２受容体変異体が好ましい。]
[0171] 図２６は、β１−ｍ２３における６の熱安定化変異（R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M）は、ヒトβ２受容体に転用して（対応する変異K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321M）、ヒトβ２−ｍ２３を作製した際の熱安定性に対する効果を示す。ヒトβ２及びβ２−ｍ２３のＴｍは、２９℃及び４１℃の各々であり、かくして、熱安定化変異を１つの受容体から他の受容体に転用可能であることが例示される。したがって、特に好ましいヒトβ２受容体変異体は、K60S, M82V, Y219A, C265L, L310A, F321Mの変異を含むものである。] 図２６
[0172] 特に好ましいヒトβ３受容体変異体は、以下のアミノ酸：W64, M86, Y224, P284, A330及びF341の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられたものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。]
[0173] 上述の３又は４又は５又は６の変異の組み合わせを有するヒトβ３受容体変異体が、好ましい。]
[0174] 特に好ましい変異の組み合わせは、実施例１の表１及び２に詳細に記載しており、適切な変異体は、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体変異体を含み、さらに、対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸、典型的には実施例１の表１及び２に示すものと同じアミノ酸に置き換えられている、β−アドレナリン受容体変異体も含む。]
[0175] 特に好ましい変異体は、シチメンチョウβ−アドレナリン受容体を参照して挙げられているアミノ酸残基に対応するアミノ酸に変異を含有するものである(R68S, Y227A, A282L,A334L) (下記の表２のm6-10参照); (M90V, Y227A, F338M) (下記の表２のm7-7参照); (R68S, M90V, V230A, F327A, A334L) (下記の表２のm10-8参照); 及び (R68S, M90V, Y227A, A282L, F327A, F338M) (下記の表２のm23参照)。]
[0176] アデノシン受容体変異体

アデノシン受容体は当該技術分野においてよく知られている。それらは互いに配列相同性を共有し、アデノシンに結合する。]
[0177] １つの実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体は、対応する野生型アデノシンと比較した際に、図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けによる以下の位置:Ｇｌｙ １１４，Ｇｌｙ １１８，Ｌｅｕ １６７，Ａｌａ １８４，Ａｒｇ １９９，Ａｌａ ２０３，Ｌｅｕ ２０８，Ｇｌｎ ２１０，Ｓｅｒ ２１３，Ｇｌｕ ２１９，Ａｒｇ ２２０，Ｓｅｒ ２２３，Ｔｈｒ ２２４，Ｇｌｎ ２２６，Ｌｙｓ ２２７，Ｈｉｓ ２３０，Ｌｅｕ ２４１，Ｐｒｏ ２６０，Ｓｅｒ ２６３，Ｌｅｕ ２６７，Ｌｅｕ ２７２，Ｔｈｒ ２７９，Ａｓｎ ２８４，Ｇｌｎ ３１１，Ｐｒｏ ３１３，Ｌｙｓ ３１５，Ａｌａ ５４，Ｖａｌ ５７，Ｈｉｓ ７５，Ｔｈｒ ８８，Ｇｌｙ １１４，Ｇｌｙ １１８，Ｔｈｒ １１９，Ｌｙｓ １２２，Ｇｌｙ １２３，Ｐｒｏ １４９，Ｇｌｕ １５１，Ｇｌｙ １５２，Ａｌａ ２０３，Ａｌａ ２０４，Ａｌａ ２３１，Ｌｅｕ ２３５，Ｖａｌ ２３９の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、アデノシン受容体変異体である。]
[0178] アデノシン受容体変異体は任意のアデノシン受容体の変異体であってよいが、所定のヒトアデノシンＡ２ａ受容体アミノ酸配列を参照して記載されるアミノ酸位置の１つ又は複数において変異されている。]
[0179] ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して測定すると、ＧＰＣＲ変異体が所定のヒトアデノシンＡ２ａ受容体配列を比較した際に、少なくとも２０％の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％の配列同一性を有する。典型的には、より高い程度の配列保存がアデノシン結合部位に存在する。]
[0180] 以下の実施例２に記載するように、（図１０に示す）ヒトアデノシンＡ２ａ受容体配列の以下のアミノ酸残基：Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, Lys 315の個々の置き換えは、アゴニストである５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ）を使用して測定した際の熱安定性における増大を引き起こす。]
[0181] （図１０に示す）ヒトＡ２ａ受容体配列における以下のアミノ酸残基：Ala 54, Val 57, His 75, Thr88, Gly 114, Gly 118, Thr 119, Lys 122, Gly 123, Pro 149, Glu 151,Gly 152, Ala 203, Ala 204, Ala 231, Leu 235, Val 239の置き換えは、アンタゴニストであるＺＭ２４１３８５（4-[2-[[7-アミノ-2-(2-フリル) [1,2,4]-トリアゾロ[2,3-α][1,3,5]トリアジン-5-イル]アミノ]エチル]フェノール）を使用して測定した際の熱安定性の増大を引き起こす。]
[0182] かくして、親と比較すると、これらのアミノ酸残基の１つ又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられているヒトアデノシンＡ２ａ受容体変異体を使用してよい。親受容体における１つ又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基に置き換えられている、他の起源に由来するアデノシン受容体変異体も使用してよい。]
[0183] １つの実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有するアデノシン受容体変異体であり、前記受容体変異体は、親受容体と比較して、図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けによる以下の位置:Ｇｌｙ １１４，Ｇｌｙ １１８，Ｌｅｕ １６７，Ａｌａ １８４，Ａｒｇ １９９，Ａｌａ ２０３，Ｌｅｕ ２０８，Ｇｌｎ ２１０，Ｓｅｒ ２１３，Ｇｌｕ ２１９，Ａｒｇ ２２０，Ｓｅｒ ２２３，Ｔｈｒ ２２４，Ｇｌｎ ２２６，Ｌｙｓ ２２７，Ｈｉｓ ２３０，Ｌｅｕ ２４１，Ｐｒｏ ２６０，Ｓｅｒ ２６３，Ｌｅｕ ２６７，Ｌｅｕ ２７２，Ｔｈｒ ２７９，Ａｓｎ ２８４，Ｇｌｎ ３１１，Ｐｒｏ ３１３，Ｌｙｓ ３１５．のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する。]
[0184] 誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するアデノシン受容体であってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。]
[0185] 「対応するアミノ酸残基」によって、ヒトアデノシン受容体Ａ２ａ受容体及び他のアデノシン受容体をＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて比較する際に、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体における所定のアミノ酸残基に対して整列（アライン）する他のアデノシン受容体におけるアミノ酸残基が含まれる。]
[0186] 図１０は、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体及び３種の他のヒトアデノシン受容体（Ａ２ｂ、Ａ３、及びＡ１）の間のアラインメントを示す。]
[0187] 例えば、Ａ２ｂ受容体（ＡＡ２ＢＲと示されている）におけるＳｅｒ１１５がＡ２ａ受容体のＧｌｙ１１４と対応することが認められる。同様に、Ａ３受容体（ＡＡ３Ｒと示されている）におけるＡｌａ６０がＡ２ａ受容体におけるＡｌａ５４に対応することなどが認められる。ヒトアデノシン受容体Ａ２ｂ、Ａ３ 、及びＡ１における他の対応するアミノ酸残基は、図１０を参照して容易に同定することが可能である。]
[0188] 親の特定のアミノ酸がＡｌａに置き換わることが好ましい。しかしながら、親の特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置き換えることが好ましい。]
[0189] アデノシン受容体変異体が、２以上のアミノ酸の位置において親と比較して異なるアミノ酸を有することが好ましい。特に好ましいヒトアデノシンＡ２ｂ受容体は、以下のアミノ酸残基：A55, T89, R123, L236 及びV240の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換わっているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。]
[0190] ３又は４又は５の上述の変異を有するヒトアデノシンＡ２ｂ受容体変異体が好ましい。]
[0191] 特に好ましいヒトアデノシンＡ３受容体は、以下のアミノ酸残基：A60, T94, W128, L232 及びL236の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（
ただし、それらが既に存在する場合を除く）。]
[0192] ３又は４又は５の上述の変異を有するヒトアデノシンＡ３受容体変異体が好ましい。]
[0193] 特に好ましいヒトアデノシンＡ１受容体は、以下のアミノ酸残基：A57, T91, A125, L236, 及びL240の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基が、Ala又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。]
[0194] 変異の特に好ましい組み合わせは実施例２に詳細に記載している。適切な変異体は、これらのヒトアデノシンＡ２ａ受容体変異体を含み、さらに、対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸、典型的には実施例２に示すものと同じアミノ酸に置き換えられている他のアデノシン受容体変異体も含む。]
[0195] 特に好ましいアデノシン受容体変異体は、ヒトアデノシンＡ２ａ受容体を参照して挙げられているアミノ酸残基に対応するアミノ酸に変異を含有するものである(A54L, K122A, L235A) (Rant 17); (A54L,T88A, V239A, A204L) (Rant 19); 及び(A54L, T88A, V239A, K122A) (Rant 21)。]
[0196] ニューロテンシン受容体変異体

ニューロテンシン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ニューロテンシンに結合する。]
[0197] １つの実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体は、対応する野生型のニューロテンシン受容体と比較した際に、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けによる以下の位置:Ａｌａ ６９，Ｌｅｕ ７２，Ａｌａ ７３，Ａｌａ ８６，Ａｌａ ９０，Ｓｅｒ １００，Ｈｉｓ １０３，Ｓｅｒ １０８，Ｌｅｕ １０９，Ｌｅｕ １１１，Ａｓｐ １１３，Ｉｌｅ １１６，Ａｌａ １２０，Ａｓｐ １３９，Ｐｈｅ １４７，Ａｌａ １５５，Ｖａｌ １６５，Ｇｌｕ １６６，Ｌｙｓ １７６，Ａｌａ １７７，Ｔｈｒ １７９，Ｍｅｔ １８１，Ｓｅｒ １８２，Ａｒｇ １８３，Ｐｈｅ １８９，Ｌｅｕ ２０５，Ｔｈｒ ２０７，Ｇｌｙ ２０９，Ｇｌｙ ２１５，Ｖａｌ ２２９，Ｍｅｔ ２５０，Ｉｌｅ ２５３，Ｌｅｕ ２５６，Ｉｌｅ ２６０，Ａｓｎ ２６２，Ｖａｌ ２６８，Ａｓｎ ２７０，Ｔｈｒ ２７９，Ｍｅｔ ２９３，Ｔｈｒ ２９４，Ｇｌｙ ３０６，Ｌｅｕ ３０８，Ｖａｌ ３０９，Ｌｅｕ ３１０，Ｖａｌ ３１３，Ｐｈｅ ３４２，Ａｓｐ ３４５，Ｔｙｒ ３４９，Ｔｙｒ ３５１，Ａｌａ ３５６，Ｐｈｅ ３５８，Ｖａｌ ３６０，Ｓｅｒ ３６２，Ａｓｎ ３７０，Ｓｅｒ ３７３，Ｐｈｅ ３８０，Ａｌａ ３８５，Ｃｙｓ ３８６，Ｐｒｏ ３８９，Ｇｌｙ ３９０，Ｔｒｐ ３９１，Ａｒｇ ３９２，Ｈｉｓ ３９３，Ａｒｇ ３９５，Ｌｙｓ ３９７，Ｐｒｏ ３９９の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、ニューロテンシン受容体変異体である。]
[0198] ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して測定すると、ＧＰＣＲ変異体が所定のラットニューロテンシン受容体配列を比較した際に、少なくとも２０％の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％の配列同一性を有する。]
[0199] ニューロテンシン受容体変異体は任意のニューロテンシン受容体変異体であってよいが、所定のラットニューロテンシン受容体アミノ酸配列を参照して言及されるアミノ酸位置の１つ又は複数で変異している。]
[0200] 以下の実施例３に記載しているように、（図１１及び２８に示す）ラットニューロテンシン受容体配列の以下のアミノ酸残基：Leu 72, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111,Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Lys 176, Thr 179, Met 181, Ser 182, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Leu 256, Asn 262, Val 268, Met 293, Asp 345, Tyr349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358,Ser 362, Ala 385, Cys 386, Trp 391, Arg 392, His 393, Lys 397, Pro 399 の個々の置き換えは、ニューロテンシンの不在下について考えた際に熱安定性における増大を引き起こす。]
[0201] 以下の実施例３に記載のように、（図１１及び２８に記載の）ラットニューロテンシン受容体配列における以下のアミノ酸残基：Ala 69, Ala 73, Ala 86, Ala 90, His 103, Val 165, Glu 166, Ala 177, Arg 183, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Ile 260, Thr 279, Thr 294, Gly 306, Leu 308,Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Phe 358,Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Pro 389, Gly 390, Arg 395 の個々の置き換えは、ニューロテンシンの存在下について考えると、熱安定性における増大を引き起こす。]
[0202] かくして、親と比較すると、これらのアミノ酸残基の１つ又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられているラットニューロテンシン受容体変異体を使用してよい。親受容体における１つ又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基に置き換えられている、他の起源に由来するニューロテンシン受容体変異体も使用してよい。]
[0203] １つの実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有するニューロテンシン受容体変異体であり、前記受容体変異体は、親受容体と比較して、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けによる以下の位置:Ａｌａ ６９，Ｌｅｕ ７２，Ａｌａ ７３，Ａｌａ ８６，Ａｌａ ９０，Ｓｅｒ １００，Ｈｉｓ １０３，Ｓｅｒ １０８，Ｌｅｕ １０９，Ｌｅｕ １１１，Ａｓｐ １１３，Ｉｌｅ １１６，Ａｌａ １２０，Ａｓｐ １３９，Ｐｈｅ １４７，Ａｌａ １５５，Ｖａｌ １６５，Ｇｌｕ １６６，Ｌｙｓ １７６，Ａｌａ １７７，Ｔｈｒ １７９，Ｍｅｔ １８１，Ｓｅｒ １８２，Ａｒｇ １８３，Ｐｈｅ １８９，Ｌｅｕ ２０５，Ｔｈｒ ２０７，Ｇｌｙ ２０９，Ｇｌｙ ２１５，Ｖａｌ ２２９，Ｍｅｔ ２５０，Ｉｌｅ ２５３，Ｌｅｕ ２５６，Ｉｌｅ ２６０，Ａｓｎ ２６２，Ｖａｌ ２６８，Ａｓｎ ２７０，Ｔｈｒ ２７９，Ｍｅｔ ２９３，Ｔｈｒ ２９４，Ｇｌｙ ３０６，Ｌｅｕ ３０８，Ｖａｌ ３０９，Ｌｅｕ ３１０，Ｖａｌ ３１３，Ｐｈｅ ３４２，Ａｓｐ ３４５，Ｔｙｒ ３４９，Ｔｙｒ ３５１，Ａｌａ ３５６，Ｐｈｅ ３５８，Ｖａｌ ３６０，Ｓｅｒ ３６２，Ａｓｎ ３７０，Ｓｅｒ ３７３，Ｐｈｅ ３８０，Ａｌａ ３８５，Ｃｙｓ ３８６，Ｐｒｏ ３８９，Ｇｌｙ ３９０，Ｔｒｐ ３９１，Ａｒｇ ３９２，Ｈｉｓ ３９３，Ａｒｇ ３９５，Ｌｙｓ ３９７，Ｐｒｏ ３９９のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する。]
[0204] 誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するニューロテンシン受容体であってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質若しくはその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してもよいが、リガンド結合能を保持する。]
[0205] 「対応するアミノ酸残基」によって、ラットニューロテンシン受容体と他のニューロテンシン受容体とをＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷとを使用して比較する際に、ラットニューロテンシン受容体における所定のアミノ酸残基に対して整列（アライン）する他のニューロテンシン受容体におけるアミノ酸残基が含まれる。]
[0206] 図１１は、ラットニューロテンシン受容体と２つのヒトニューロテンシン受容体１及び２との間のアラインメントを示す。例えば、ヒトニューロテンシン受容体１のＡｌａ８５がラットニューロテンシン受容体のＡｌａ８６が対応し；ヒトニューロテンシン受容体１のＰｈｅ３５３がラットニューロテンシン受容体のＰｈｅ３５８に対応することなどが認められる。ヒトニューロテンシン受容体１及び２における他の対応するアミノ酸残基は、図１１を参照して容易に同定可能である。]
[0207] 親の特定のアミノ酸残基がＡｌａに置き換えられることが好ましい。しかしながら、親の特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置き換えられることが好ましい。]
[0208] ニューロテンシン受容体変異体は、２以上のアミノ酸の位置において、親と比較すると異なるアミノ酸を有することが好ましい。特に好ましいヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ１）は、以下のアミノ酸残基：Ala 85, His 102, Ile 259, Phe 337 及びPhe 353の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基がAla又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。]
[0209] ３又は４又は５の上述の変異を有するヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ１）が好ましい。]
[0210] 特に好ましいヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ２）は、以下のアミノ酸残基：V54,R69, T229, P331 及びF347の１つ又は複数が他のアミノ酸残基で置き換えられているものである。典型的には、所定のアミノ酸残基がAla又はVal又はMet又はLeu又はIleで置きかえられる（ただし、それらが既に存在する場合を除く）。３又は４又は５の上述の変異を有するヒトニューロテンシン受容体（ＮＴＲ２）が好ましい。]
[0211] 特に好ましい変異の組み合わせは、実施例３に詳細に記載している。適切な変異体は、これらのラットニューロテンシン受容体変異体を含み、さらに、対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸、典型的には実施例３に示すものと同じアミノ酸に置き換えられている、他のニューロテンシン受容体変異体も含む。]
[0212] 特に好ましいニューロテンシン受容体変異得体は、ラットニューロテンシン受容体を参照して挙げられているアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基における変異を含有するものである(F358A, A86L, I260A, F342A) (Nag7m); (F358A, H103A, I260A, F342A) (Nag7n)
。]
[0213] ムスカリン受容体変異体

ムスカリン受容体は当該技術分野において知られている。それらは配列相同性を共有し、ムスカリンに結合する。]
[0214] １つの実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体は、対応する野生型のムスカリン受容体と比較した際に、図１７に記載のヒトムスカリン受容体Ｍ１の番号付けによる以下の位置: Ｌｅｕ ６５、Ｍｅｔ １４５、Ｌｅｕ ３９９、Ｉｌｅ ３８３及びＭｅｔ ３８４の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有する、ムスカリン受容体変異体である。]
[0215] ＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して測定すると、ＧＰＣＲ変異体が所定のヒトムスカリン受容体配列を比較した際に、少なくとも２０％の配列同一性を有するものであることが特に好ましい。好ましくは、ＧＰＣＲ変異体は、少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％の配列同一性を有する。]
[0216] ムスカリン受容体変異体は、任意のムスカリン受容体の変異体であってよいが、所定のムスカリン受容体アミノ酸配列を参照して挙げられているアミノ酸の位置の１つ又は複数で変異されている。]
[0217] かくして、親と比較すると、これらのアミノ酸残基の１つ又は複数が他のアミノ酸残基によって置き換えられているヒトムスカリン受容体変異体を使用してよい。親受容体における１つ又は複数の対応するアミノ酸が他のアミノ酸残基に置き換えられている、他の起源に由来するムスカリン受容体変異体も使用してよい。]
[0218] 誤解を避けるために言及すると、前記親は、天然の配列を有するムスカリン受容体であってよく、又は切断型であってよく、又は天然のタンパク質又はその断片に対する融合体であってよく、又は天然の配列と比較して変異を含有してよいが、リガンド結合能を保持する。]
[0219] １つの実施態様では、当該ＧＰＣＲ変異体はムスカリン受容体変異体である。例えば、ムスカリン受容体変異体は、構造モチーフに少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有してよく、前記受容体変異体は、親受容体と比較して、図１７に記載のヒトムスカリン受容体の番号付けによる以下の位置: Ｌｅｕ ６５、Ｍｅｔ １４５、Ｌｅｕ ３９９、Ｉｌｅ ３８３及びＭｅｔ ３８４のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する。]
[0220] 「対応するアミノ酸残基」によって、ヒトムスカリン受容体と他のムスカリン受容体とをＭａｃＶｅｃｔｏｒ及びＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して比較した際に、ヒトムスカリン受容体における所定のアミノ酸に対して整列（アライン）する他のムスカリン受容体におけるアミノ酸残基が含まれる。]
[0221] 特定のアミノ酸残基がＡｌａで置き換えられることが好ましい。しかしながら、特定のアミノ酸残基がＡｌａである際は、Ｌｅｕで置き換えられることが好ましい。]
[0222] 本発明で使用するＧＰＣＲ変異体は、熱、界面活性剤、カオトロピック剤、及び極端なｐＨのいずれか１つに対する増大した安定性を有することが好ましい。]
[0223] 本発明で使用するＧＰＣＲ変異体は増大した熱安定性を有することが好ましい。]

权利要求:

請求項1
ＧＰＣＲの結合パートナーを生産する方法であって、ａ）親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造で増大した安定性を有する、該親ＧＰＣＲのＧＰＣＲ変異体を提供する工程、ｂ）１つ又は複数の試験化合物を提供する工程、ｃ）前記試験化合物又はその各々が、特定の立体構造を備える場合の前記ＧＰＣＲ変異体に結合するか否かを測定する工程、及びｄ）前記特定の立体構造を備える場合の前記ＧＰＣＲ変異体に結合する１つ又は複数の試験化合物を単離する工程を含む方法。
請求項2
ｅ）前記試験化合物又はその各々が、前記特定の立体構造を備える場合の前記親ＧＰＣＲに結合するか否かを測定する工程、及びｆ）前記特定の立体構造にある場合の前記親ＧＰＣＲにも結合する前記試験化合物又はその各々を単離する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
請求項3
前記ＧＰＣＲ変異体が固体支持体に固定化されている、請求項１又は２に記載の方法。
請求項4
前記支持体がビーズ、カラム、スライドガラス、チップ又はプレートのいずれかである、請求項３に記載の方法。
請求項5
前記ＧＰＣＲ変異体が共有結合相互作用を介して支持体に固定化されている、請求項３又は４に記載の方法。
請求項6
前記支持体がポリマー支持体で被覆されている、請求項５に記載の方法。
請求項7
前記ポリマー支持体がカルボキシル化デキストランである、請求項６に記載の方法。
請求項8
前記ＧＰＣＲ変異体が非共有結合相互作用を介して支持体に固定化されている、請求項３又は４に記載の方法。
請求項9
前記支持体が、アビジン、ストレプトアビジン、金属イオン、親ＧＰＣＲに対する抗体、又は前記ＧＰＣＲ変異体に結合した分子タグに対する抗体のいずれかで被覆されている、請求項８に記載の方法。
請求項10
前記ＧＰＣＲ変異体が、Ｃ末端又は細胞外ドメインが外側を向くように細胞内ドメインを介して固定化されている、請求項３から９のいずれか一項に記載の方法。
請求項11
前記ＧＰＣＲ変異体が、Ｎ末端又は細胞内ドメインが外側を向くように細胞外ドメインを介して固定化されている、請求項３から９のいずれか一項に記載の方法。
請求項12
前記ＧＰＣＲ変異体がＣ末端又はＮ末端に分子タグを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項13
前記タグが、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＤＤＤＤＫタグ、ＨＳＶタグ、Ｈａｌｏタグ、又はビオチンタグのいずれかである、請求項１０に記載の方法。
請求項14
前記ＧＰＣＲ変異体が、全細胞製剤中又は細胞膜断片中に存在するか、界面活性剤に可溶化されているか、脂質単層中、脂質二重層中、ビーズ結合脂質粒子中、固体支持脂質層中、又はプロテオリポソーム中に存在する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
請求項15
前記試験化合物が固体支持体に固定化されている、請求項１、２、１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
請求項16
前記固体支持体がビーズ、カラム、スライドガラス、チップ又はプレートのいずれかである、請求項１５に記載の方法。
請求項17
前記ＧＰＣＲ変異体及び前記試験化合物が固体支持体に固定化されていない、請求項１、２、１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
請求項18
前記試験化合物が、ポリペプチド；アンチカリン；ペプチド；抗体；キメラ抗体；一本鎖抗体；アプタマー；ダルピン；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ若しくはｄＡｂ抗体断片；低分子；天然生成物；アフィボディ；ペプチドミメティック；核酸；ペプチド核酸分子；脂質；炭水化物；アンキリンリピートタンパク質、アルマジロリピートタンパク質、ロイシンリッチタンパク質、テトラトリオペプチドリピートタンパク質若しくは設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を含むモジュールフレームワークに基づくタンパク質；又はリポカリン若しくはフィブロネクチンドメイン又はヒトγクリスタリン若しくはヒトユビキチンのいずれかに基づくアフィリンスカフォールドに基づくタンパク質のいずれかである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
請求項19
前記試験化合物が生物学的試料として提供される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
請求項20
前記試料が血液、血清、血漿、脊髄液、組織抽出物又は細胞抽出物のいずれかである、請求項１９に記載の方法。
請求項21
前記試験化合物が、試験化合物のライブラリーである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
請求項22
前記ライブラリーが、ペプチドライブラリー、タンパク質ライブラリー、抗体ライブラリー、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー、又はｓｃＦｖ若しくはＦａｂファージディスプレイライブラリーのいずれかである、請求項２０に記載の方法。
請求項23
前記試験化合物が、ペプチドタグ、核酸タグ、化学物質タグ、蛍光タグ又はＲＦタグのいずれかで標識されている、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
請求項24
前記抗体が、親ＧＰＣＲのＧＰＣＲ変異体に対する抗体であり、前記ＧＰＣＲ変異体が前記親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造で増大した安定性を有する、請求項１８に記載の方法。
請求項25
前記抗体が、リンパ球を前記ＧＰＣＲ変異体の免疫原で免疫することによって作製される、請求項２４に記載の方法。
請求項26
前記リンパ球がインビボで免疫される、請求項２５に記載の方法。
請求項27
前記リンパ球がインビトロで免疫される、請求項２５に記載の方法。
請求項28
前記ＧＰＣＲ変異体の免疫原が、前記ＧＰＣＲ変異体の全部、その断片又はその融合タンパク質である、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
請求項29
ＧＰＣＲ変異体の免疫原が、全細胞製剤中若しくは細胞膜断片中で提供されるか、界面活性剤に可溶化されているか、脂質単層中、脂質二重層中、ビーズ結合脂質粒子中、固体支持脂質層中、又はプロテオリポソーム中で提供される、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
請求項30
前記免疫原がアジュバントと共に提供される、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
請求項31
前記アジュバントがＴｉｔｒｅｍａｘ又はＲｉｂｉアジュバント乳剤である、請求項３０に記載の方法。
請求項32
特定の立体構造を備える場合のＧＰＣＲ変異体に結合する前記単離試験化合物を修飾する工程、及び前記修飾した試験化合物が特定の立体構造を備える場合の前記ＧＰＣＲ変異体に結合するか否かを測定する工程をさらに含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
請求項33
前記修飾試験化合物が、前記特定の立体構造を備える場合の前記親ＧＰＣＲに結合するか否かを測定する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
請求項34
複数のＧＰＣＲ変異体が工程（ａ）で提供され、前記試験化合物が特定の立体構造を備える場合の各々のＧＰＣＲ変異体に結合するか否かを測定し、前記特定の立体構造を備える場合の各々のＧＰＣＲ変異体に結合する試験化合物を単離する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
請求項35
第一の親ＧＰＣＲのＧＰＣＲ変異体及び第二の親ＧＰＣＲのＧＰＣＲ変異体が工程（ａ）で提供され、前記試験化合物が特定の立体構造を備える場合の各々のＧＰＣＲ変異体に結合するか否かを測定し、前記特定の立体構造を備える場合の各々のＧＰＣＲ変異体に結合する試験化合物を単離する、請求項３４に記載の方法。
請求項36
複数のＧＰＣＲ変異体が工程（ａ）で提供され、第一のＧＰＣＲ変異体に結合するが、少なくとも１つの他のＧＰＣＲ変異体には結合しない又は前記第一のＧＰＣＲ変異体に対するよりも弱く結合する試験化合物を選択する、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
請求項37
請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法であって、（ｉ）前記単離試験化合物が、それが結合する前記ＧＰＣＲの機能に影響を及ぼすか否かを測定する工程、及び（ｉｉ）それが結合する前記ＧＰＣＲの機能に影響を及ぼす試験化合物を単離する工程、をさらに含む方法。
請求項38
工程（ｉ）において、前記単離試験化合物が、その天然リガンド又はその類似体への前記ＧＰＣＲの結合に影響を及ぼすか否かを測定する、請求項３７に記載の方法。
請求項39
工程（ｉｉ）において、前記ＧＰＣＲとその天然リガンド又はその類似体の間の結合を低下させる試験化合物を単離する、請求項３８に記載の方法。
請求項40
工程（ｉｉ）において、前記ＧＰＣＲとその天然リガンド又はその類似体の間の結合を上昇させる試験化合物を単離する、請求項３８に記載の方法。
請求項41
工程（ｉ）において、前記単離試験化合物が、それが結合する前記ＧＰＣＲの活性化を調節するか否かを測定する、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
請求項42
工程（ｉｉ）において、カルシウム可動化、ｃＡＭＰレベル、キナーゼ経路の活性、試験化合物が結合するＧＰＣＲの制御下でのレポーター遺伝子からの遺伝子転写、β−アレスチンのリクルートメント、Ｇタンパク質の活性化、ＧＴＰアーゼ活性又は［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合のいずれかを調節する試験化合物を選択する、請求項４１に記載の方法。
請求項43
工程（ｉｉ）において、それが結合する前記ＧＰＣＲの活性化を上昇させるアゴニスト試験化合物を単離する、請求項４１又は４２に記載の方法。
請求項44
工程（ｉｉ）において、それが結合する前記ＧＰＣＲの活性化を低下させるアンタゴニスト試験化合物を単離する、請求項４１又は４２に記載の方法。
請求項45
請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法であって、ＧＰＣＲ変異体が、（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、（ｂ）前記ＧＰＣＲが特定の立体構造を備える場合に前記親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択する工程、（ｃ）前記ＧＰＣＲ変異体又はその各々が、前記選択したリガンドへの結合に関して、そのリガンドへの結合に関する前記親ＧＰＣＲの安定性と比較して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、及び（ｄ）前記選択したリガンドへの結合に関して前記親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程によって提供される方法。
請求項46
工程（ｃ）の前に、前記１つ又は複数の変異体を前記選択したリガンドと接触させる、請求項４５に記載の方法。
請求項47
前記１つ又は複数の変異体が可溶化形態で提供される、請求項４５又は４６に記載の方法。
請求項48
請求項４５から４７のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｃ）において前記ＧＰＣＲが備える前記特定の立体構造が、工程（ｂ）で選択したリガンドのクラスに対応する方法。
請求項49
前記選択したリガンドがアゴニストクラスのリガンドに由来するものであり、且つ前記特定の立体構造がアゴニスト立体構造であるか、又は前記選択したリガンドがアンタゴニストクラスのリガンドに由来するものであり、且つ前記特定の立体構造がアンタゴニスト立体構造である、請求項４８に記載の方法。
請求項50
前記選択したリガンドがアゴニストクラスのリガンドに由来するものであり、且つ、工程（ｃ）において前記ＧＰＣＲが備える前記特定の立体構造がアゴニスト立体構造である、請求項４９に記載の方法。
請求項51
前記選択したリガンドに対する前記変異体の結合親和性が、前記選択したリガンドに対する前記親の結合親和性と実質的に同一であるか又はそれよりも大きい、請求項４５から５０のいずれか一項に記載の方法。
請求項52
前記方法が１回又は複数回反復され、工程（ａ）において増大した安定性を有する前記選択した変異体が前記方法のその後の回における前記親ＧＰＣＲとなる、請求項４５から５１のいずれか一項に記載の方法。
請求項53
熱、界面活性剤、カオトロピック剤、及び極端なｐＨのいずれか１つ又は複数に対して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択する、請求項４５から５２のいずれか一項に記載の方法。
請求項54
増大した熱安定性を有するＧＰＣＲ変異体を選択する、請求項５３に記載の方法。
請求項55
前記リガンドが、完全アゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニストのいずれか１つである、請求項４５から５４のいずれか一項に記載の方法。
請求項56
前記リガンドが前記ＧＰＣＲに結合するポリペプチドである、請求項４５から５５のいずれか一項に記載の方法。
請求項57
前記ポリペプチドが、抗体、アンキリン、Ｇタンパク質、ＲＧＳタンパク質、アレスチン、ＧＰＣＲキナーゼ、受容体チロシンキナーゼ、ＲＡＭＰ、ＮＳＦ、ＧＰＣＲ、ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１若しくはＮＲ２ａ、又はカルシオン、フィブロネクチンドメインフレームワーク、又は前記ＧＰＣＲに結合するその断片若しくは誘導体のいずれかである、請求項５６に記載の方法。
請求項58
工程（ｂ）において２又はそれ以上のリガンドが選択され、各々の存在が前記ＧＰＣＲに同じ特定の立体構造を備えさせる、請求項４５から５７のいずれか一項に記載の方法。
請求項59
親と比較して、工程（ｂ）で選択した前記リガンドとは異なるクラスのリガンドに結合する低下した能力を有するＧＰＣＲ変異体を選択する、請求項４５から５８のいずれか一項に記載の方法。
請求項60
前記ＧＰＣＲが、β−アドレナリン受容体、アデノシン受容体及びニューロテンシン受容体のいずれか１つである、請求項４５から５９のいずれか一項に記載の方法。
請求項61
請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法であって、前記ＧＰＣＲ変異体が、（ａ）請求項４５から６０のいずれか一項に記載の方法を実施する工程、（ｂ）増大した安定性に関して選択した前記１つ又は複数のＧＰＣＲ変異体における１つ又は複数の変異したアミノ酸残基の位置を同定する工程、及び（ｃ）前記同定した位置の１つ又は複数におけるアミノ酸の置き換えを含むＧＰＣＲ変異体を合成する工程によって提供される方法。
請求項62
前記ＧＰＣＲ変異体が親ＧＰＣＲと比較して複数の変異を含む、請求項６１に記載の方法。
請求項63
請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法であって、前記ＧＰＣＲ変異体が、（ｉ）第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体のアミノ酸配列において、１つ又は複数の変異体が前記第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する１つ又は複数の位置を同定する工程、及び（ｉｉ）対応する１つ又は複数の位置で、第二のＧＰＣＲを規定するアミノ酸配列内に１つ又は複数の変異を作製して、第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程によって提供される方法。
請求項64
第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体が、請求項４５から６２のいずれか一項に記載の方法にしたがって提供される、請求項６３に記載の方法。
請求項65
前記第二のＧＰＣＲが、前記第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲクラス又はファミリーのものである、請求項６３又は６４に記載の方法。
請求項66
前記第二のＧＰＣＲが、前記第一の親ＧＰＣＲと少なくとも２０％の配列同一性を有するＧＰＣＲである、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
請求項67
親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有するＧＰＣＲ変異体を生産する、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法であって、（ｉ）第一の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第一の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、（ｉｉ）膜タンパク質構造モデルにおいて、１つ又は複数の変異体が前記第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する１つ又は複数の構造モチーフを同定する工程、及び（ｉｉｉ）第二の親ＧＰＣＲにおいて対応する１つ又は複数の構造モチーフを規定するアミノ酸配列内に１つ又は複数の変異を作製して、前記第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する第二の親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程を含む方法。
請求項68
前記膜タンパク質構造モデルが内在性膜タンパク質のモデルである、請求項６７に記載の方法。
請求項69
前記内在性膜タンパク質が、工程（ｉ）の前記第一の親ＧＰＣＲの変異体が前記第一の親ＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの異なる前記変異体中のアミノ酸を有するタンパク質ドメインにわたって、前記第一の親ＧＰＣＲの変異体と少なくとも２０％の配列同一性を有する、請求項６７又は６８に記載の方法。
請求項70
前記内在性膜タンパク質がＧＰＣＲである、請求項６８又は６９に記載の方法。
請求項71
前記ＧＰＣＲが、前記第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲクラス又はファミリーのものである、請求項７０に記載の方法。
請求項72
前記膜タンパク質構造モデルが、ヒトβ２アドレナリン受容体又はウシロドプシンのモデルである、請求項６７から７１のいずれか一項に記載の方法。
請求項73
前記構造モチーフが、へリックス界面、へリックスの折れ曲がり（キンク）、へリックスの折れ曲がり（キンク）の反対側のへリックス、脂質二重層に向いたへリックス表面、疎水性−親水性境界層の脂質二重層に向いたへリックス表面、ループ領域、又はタンパク質結合ポケットのいずれかである、請求項６７から７２のいずれか一項に記載の方法。
請求項74
前記第二の親ＧＰＣＲが前記第一の親ＧＰＣＲである、請求項６７から７３のいずれか一項に記載の方法。
請求項75
前記第二の親ＧＰＣＲが前記第一の親ＧＰＣＲではない、請求項６７から７３のいずれか一項に記載の方法。
請求項76
前記第二の親ＧＰＣＲが、前記第一の親ＧＰＣＲと少なくとも２０％の配列同一性を有するＧＰＣＲである、請求項７４又は７５に記載の方法。
請求項77
前記第二のＧＰＣＲが、前記第一の親ＧＰＣＲと同じＧＰＣＲクラス又はファミリーのものである、請求項７４から７６のいずれか一項に記載の方法。
請求項78
請求項６３から７７のいずれか一項に記載の方法であって、（Ｉ）前記第二の親ＧＰＣＲが特定の立体構造を備える場合に前記第二の親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択する工程、（ＩＩ）特定の立体構造を備える場合の前記第二の親ＧＰＣＲの前記変異体又はその各々が、前記選択したリガンドへの結合に関して同じ特定の立体構造を備える場合の前記第二の親ＧＰＣＲの安定性と比較して、そのリガンドへの結合に関して増大した安定性を有するか否かを測定する工程、及び（ＩＩＩ）前記選択したリガンドへの結合に関して、前記第二の親ＧＰＣＲと比較して増大した安定性を有する変異体を選択する工程をさらに含む方法。
請求項79
工程（ＩＩ）において前記ＧＰＣＲが備える前記特定の立体構造が、工程（Ｉ）で選択したリガンドのクラスに対応する、請求項７８に記載の方法。
請求項80
前記選択したリガンドがアゴニストクラスのリガンドに由来するものであり、且つ前記特定の立体構造がアゴニスト立体構造であるか、又は前記選択したリガンドがアンタゴニストクラスのリガンドに由来するものであり、且つ前記特定の立体構造がアンタゴニスト立体構造である、請求項７９に記載の方法。
請求項81
前記リガンドが請求項５５から５７のいずれか一項で規定されるものである、請求項７８から８０のいずれか一項に記載の方法。
請求項82
前記第二のＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体の結合親和性が、前記選択したリガンドについての前記第二の親ＧＰＣＲの結合親和性と実質的に同一であるか又はそれ以上である、請求項７８から８１のいずれか一項に記載の方法。
請求項83
工程（ａ）で提供されるＧＰＣＲ変異体が、β−アドレナリン受容体、アデノシン受容体、ニューロテンシン受容体又はムスカリン受容体のいずれか１つである、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
請求項84
工程（ａ）で提供される前記ＧＰＣＲ変異体が、その親受容体と比較して、以下の位置：（ｉ）図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けによる：Ｉｌｅ５５，Ｇｌｙ６７，Ａｒｇ６８，Ｖａｌ８９，Ｍｅｔ９０，Ｇｌｙ９８，Ｉｌｅ１２９，Ｓｅｒ１５１，Ｖａｌ１６０，Ｇｌｎ１９４，Ｇｌｙ１９７，Ｌｅｕ２２１，Ｔｙｒ２２７，Ａｒｇ２２９，Ｖａｌ２３０，Ａｌａ２３４，Ａｌａ２８２，Ａｓｐ３２２，Ｐｈｅ３２７，Ａｌａ３３４，Ｐｈｅ３３８、（ｉｉ）図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けによる：Ｇｌｙ１１４，Ｇｌｙ１１８，Ｌｅｕ１６７，Ａｌａ１８４，Ａｒｇ１９９，Ａｌａ２０３，Ｌｅｕ２０８，Ｇｌｎ２１０，Ｓｅｒ２１３，Ｇｌｕ２１９，Ａｒｇ２２０，Ｓｅｒ２２３，Ｔｈｒ２２４，Ｇｌｎ２２６，Ｌｙｓ２２７，Ｈｉｓ２３０，Ｌｅｕ２４１，Ｐｒｏ２６０，Ｓｅｒ２６３，Ｌｅｕ２６７，Ｌｅｕ２７２，Ｔｈｒ２７９，Ａｓｎ２８４，Ｇｌｎ３１１，Ｐｒｏ３１３，Ｌｙｓ３１５、（ｉｉｉ）図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けによる：Ａｌａ６９，Ｌｅｕ７２，Ａｌａ７３，Ａｌａ８６，Ａｌａ９０，Ｓｅｒ１００，Ｈｉｓ１０３，Ｓｅｒ１０８，Ｌｅｕ１０９，Ｌｅｕ１１１，Ａｓｐ１１３，Ｉｌｅ１１６，Ａｌａ１２０，Ａｓｐ１３９，Ｐｈｅ１４７，Ａｌａ１５５，Ｖａｌ１６５，Ｇｌｕ１６６，Ｌｙｓ１７６，Ａｌａ１７７，Ｔｈｒ１７９，Ｍｅｔ１８１，Ｓｅｒ１８２，Ａｒｇ１８３，Ｐｈｅ１８９，Ｌｅｕ２０５，Ｔｈｒ２０７，Ｇｌｙ２０９，Ｇｌｙ２１５，Ｖａｌ２２９，Ｍｅｔ２５０，Ｉｌｅ２５３，Ｌｅｕ２５６，Ｉｌｅ２６０，Ａｓｎ２６２，Ｖａｌ２６８，Ａｓｎ２７０，Ｔｈｒ２７９，Ｍｅｔ２９３，Ｔｈｒ２９４，Ｇｌｙ３０６，Ｌｅｕ３０８，Ｖａｌ３０９，Ｌｅｕ３１０，Ｖａｌ３１３，Ｐｈｅ３４２，Ａｓｐ３４５，Ｔｙｒ３４９，Ｔｙｒ３５１，Ａｌａ３５６，Ｐｈｅ３５８，Ｖａｌ３６０，Ｓｅｒ３６２，Ａｓｎ３７０，Ｓｅｒ３７３，Ｐｈｅ３８０，Ａｌａ３８５，Ｃｙｓ３８６，Ｐｒｏ３８９，Ｇｌｙ３９０，Ｔｒｐ３９１，Ａｒｇ３９２，Ｈｉｓ３９３，Ａｒｇ３９５，Ｌｙｓ３９７，Ｐｒｏ３９９、及び（ｉｖ）図１７に記載のムスカリン受容体の番号付けによる：Ｌｅｕ６５、Ｍｅｔ１４５、Ｌｅｕ３９９、Ｉｌｅ３８３及びＭｅｔ３８４の任意の１つ又は複数に対応する位置に少なくとも１つの異なるアミノ酸を有する、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
請求項85
工程（ａ）で提供されるＧＰＣＲ変異体が、その対応する親受容体と比較した場合、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けによる以下の位置：Ｉｌｅ５５，Ｇｌｙ６７，Ａｒｇ６８，Ｖａｌ８９，Ｍｅｔ９０，Ｇｌｙ９８，Ｉｌｅ１２９，Ｓｅｒ１５１，Ｖａｌ１６０，Ｇｌｎ１９４，Ｇｌｙ１９７，Ｌｅｕ２２１，Ｔｙｒ２２７，Ａｒｇ２２９，Ｖａｌ２３０，Ａｌａ２３４，Ａｌａ２８２，Ａｓｐ３２２，Ｐｈｅ３２７，Ａｌａ３３４，Ｐｈｅ３３８．の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するβ−アドレナリン受容体変異体である、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
請求項86
前記β−アドレナリン受容体変異体が、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項８６に記載の方法。
請求項87
工程（ａ）で提供される前記ＧＰＣＲ変異体がβ−アドレナリン受容体変異体であって、前記受容体変異体が、その親受容体と比較して、図９に記載のシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けによる以下の位置：Ｉｌｅ５５，Ｇｌｙ６７，Ａｒｇ６８，Ｖａｌ８９，Ｍｅｔ９０，Ｇｌｙ９８，Ｉｌｅ１２９，Ｓｅｒ１５１，Ｖａｌ１６０，Ｇｌｎ１９４，Ｇｌｙ１９７，Ｌｅｕ２２１，Ｔｙｒ２２７，Ａｒｇ２２９，Ｖａｌ２３０，Ａｌａ２３４，Ａｌａ２８２，Ａｓｐ３２２，Ｐｈｅ３２７，Ａｌａ３３４，Ｐｈｅ３３８．のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する構造モチーフ内に少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
請求項88
工程（ａ）で提供される前記ＧＰＣＲ変異体が、その対応する親受容体と比較した場合、図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けによる以下の位置：Ｇｌｙ１１４，Ｇｌｙ１１８，Ｌｅｕ１６７，Ａｌａ１８４，Ａｒｇ１９９，Ａｌａ２０３，Ｌｅｕ２０８，Ｇｌｎ２１０，Ｓｅｒ２１３，Ｇｌｕ２１９，Ａｒｇ２２０，Ｓｅｒ２２３，Ｔｈｒ２２４，Ｇｌｎ２２６，Ｌｙｓ２２７，Ｈｉｓ２３０，Ｌｅｕ２４１，Ｐｒｏ２６０，Ｓｅｒ２６３，Ｌｅｕ２６７，Ｌｅｕ２７２，Ｔｈｒ２７９，Ａｓｎ２８４，Ｇｌｎ３１１，Ｐｒｏ３１３，Ｌｙｓ３１５．の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するアデノシン受容体変異体である、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
請求項89
前記アデノシン受容体変異体が、図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項８８に記載の方法。
請求項90
工程（ａ）で提供される前記ＧＰＣＲ変異体がアデノシン受容体変異体であって、前記受容体変異体が、その親受容体と比較して、図１０に記載のヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けによる以下の位置：Ｇｌｙ１１４，Ｇｌｙ１１８，Ｌｅｕ１６７，Ａｌａ１８４，Ａｒｇ１９９，Ａｌａ２０３，Ｌｅｕ２０８，Ｇｌｎ２１０，Ｓｅｒ２１３，Ｇｌｕ２１９，Ａｒｇ２２０，Ｓｅｒ２２３，Ｔｈｒ２２４，Ｇｌｎ２２６，Ｌｙｓ２２７，Ｈｉｓ２３０，Ｌｅｕ２４１，Ｐｒｏ２６０，Ｓｅｒ２６３，Ｌｅｕ２６７，Ｌｅｕ２７２，Ｔｈｒ２７９，Ａｓｎ２８４，Ｇｌｎ３１１，Ｐｒｏ３１３，Ｌｙｓ３１５．のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する構造モチーフ内に少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
請求項91
工程（ａ）で提供される前記ＧＰＣＲ変異体が、その対応する親受容体と比較した場合、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けによる以下の位置：Ａｌａ６９，Ｌｅｕ７２，Ａｌａ７３，Ａｌａ８６，Ａｌａ９０，Ｓｅｒ１００，Ｈｉｓ１０３，Ｓｅｒ１０８，Ｌｅｕ１０９，Ｌｅｕ１１１，Ａｓｐ１１３，Ｉｌｅ１１６，Ａｌａ１２０，Ａｓｐ１３９，Ｐｈｅ１４７，Ａｌａ１５５，Ｖａｌ１６５，Ｇｌｕ１６６，Ｌｙｓ１７６，Ａｌａ１７７，Ｔｈｒ１７９，Ｍｅｔ１８１，Ｓｅｒ１８２，Ａｒｇ１８３，Ｐｈｅ１８９，Ｌｅｕ２０５，Ｔｈｒ２０７，Ｇｌｙ２０９，Ｇｌｙ２１５，Ｖａｌ２２９，Ｍｅｔ２５０，Ｉｌｅ２５３，Ｌｅｕ２５６，Ｉｌｅ２６０，Ａｓｎ２６２，Ｖａｌ２６８，Ａｓｎ２７０，Ｔｈｒ２７９，Ｍｅｔ２９３，Ｔｈｒ２９４，Ｇｌｙ３０６，Ｌｅｕ３０８，Ｖａｌ３０９，Ｌｅｕ３１０，Ｖａｌ３１３，Ｐｈｅ３４２，Ａｓｐ３４５，Ｔｙｒ３４９，Ｔｙｒ３５１，Ａｌａ３５６，Ｐｈｅ３５８，Ｖａｌ３６０，Ｓｅｒ３６２，Ａｓｎ３７０，Ｓｅｒ３７３，Ｐｈｅ３８０，Ａｌａ３８５，Ｃｙｓ３８６，Ｐｒｏ３８９，Ｇｌｙ３９０，Ｔｒｐ３９１，Ａｒｇ３９２，Ｈｉｓ３９３，Ａｒｇ３９５，Ｌｙｓ３９７，Ｐｒｏ３９９．の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するニューロテンシン受容体変異体である、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
請求項92
前記ニューロテンシン受容体変異体が、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項９１に記載の方法。
請求項93
工程（ａ）で提供される前記ＧＰＣＲ変異体がニューロテンシン受容体変異体であって、前記受容体変異体が、その親受容体と比較して、図１１に記載のラットニューロテンシン受容体の番号付けによる以下の位置：Ａｌａ６９，Ｌｅｕ７２，Ａｌａ７３，Ａｌａ８６，Ａｌａ９０，Ｓｅｒ１００，Ｈｉｓ１０３，Ｓｅｒ１０８，Ｌｅｕ１０９，Ｌｅｕ１１１，Ａｓｐ１１３，Ｉｌｅ１１６，Ａｌａ１２０，Ａｓｐ１３９，Ｐｈｅ１４７，Ａｌａ１５５，Ｖａｌ１６５，Ｇｌｕ１６６，Ｌｙｓ１７６，Ａｌａ１７７，Ｔｈｒ１７９，Ｍｅｔ１８１，Ｓｅｒ１８２，Ａｒｇ１８３，Ｐｈｅ１８９，Ｌｅｕ２０５，Ｔｈｒ２０７，Ｇｌｙ２０９，Ｇｌｙ２１５，Ｖａｌ２２９，Ｍｅｔ２５０，Ｉｌｅ２５３，Ｌｅｕ２５６，Ｉｌｅ２６０，Ａｓｎ２６２，Ｖａｌ２６８，Ａｓｎ２７０，Ｔｈｒ２７９，Ｍｅｔ２９３，Ｔｈｒ２９４，Ｇｌｙ３０６，Ｌｅｕ３０８，Ｖａｌ３０９，Ｌｅｕ３１０，Ｖａｌ３１３，Ｐｈｅ３４２，Ａｓｐ３４５，Ｔｙｒ３４９，Ｔｙｒ３５１，Ａｌａ３５６，Ｐｈｅ３５８，Ｖａｌ３６０，Ｓｅｒ３６２，Ａｓｎ３７０，Ｓｅｒ３７３，Ｐｈｅ３８０，Ａｌａ３８５，Ｃｙｓ３８６，Ｐｒｏ３８９，Ｇｌｙ３９０，Ｔｒｐ３９１，Ａｒｇ３９２，Ｈｉｓ３９３，Ａｒｇ３９５，Ｌｙｓ３９７，Ｐｒｏ３９９．のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する構造モチーフ内に少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、請求項１から８２のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
請求項94
工程（ａ）で提供される前記ＧＰＣＲ変異体が、対応する野生型ムスカリン受容体と比較した場合、図１７に記載のヒトムスカリン受容体の番号付けによる以下の位置：Ｌｅｕ６５，Ｍｅｔ１４５，Ｌｅｕ３９９，Ｉｌｅ３８３及びＭｅｔ３８４の任意の１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するムスカリン受容体変異体である、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
請求項95
前記ムスカリン受容体変異体が、図１７に記載のラットニューロテンシン受容体の配列と少なくとも２０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項９４に記載の方法。
請求項96
工程（ａ）で提供される前記ＧＰＣＲ変異体がムスカリン受容体変異体であって、前記受容体変異体が、その親受容体と比較して、図１７に記載のヒトムスカリン受容体の番号付けによる以下の位置：Ｌｅｕ６５，Ｍｅｔ１４５，Ｌｅｕ３９９，Ｉｌｅ３８３及びＭｅｔ３８４のいずれかに対応する位置に異なるアミノ酸を有する構造モチーフ内に少なくとも１つの異なるアミノ酸残基を有する、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
請求項97
ＧＰＣＲの結合パートナーを生産する方法であって、請求項１から９６のいずれか一項に記載の方法を実施することによって同定可能な結合パートナーを合成する工程を含む方法。
請求項98
請求項１から９７に記載の方法のいずれかによって得られる結合パートナー。
請求項99
前記結合パートナーが立体構造特異的である、請求項９８に記載の結合パートナー。
請求項100
前記結合パートナーが、ポリペプチド；アンチカリン；ペプチド；抗体；キメラ抗体；一本鎖抗体；アプタマー；ダルピン；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ若しくはｄＡｂ抗体断片；低分子；天然生成物；アフィボディ；ペプチドミメティック；核酸；ペプチド核酸分子；脂質；炭水化物；アンキリンリピートタンパク質、アルマジロリピートタンパク質、ロイシンリッチタンパク質、テトラリオペプチドリピートタンパク質若しくは設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を含むモジュールフレームワークに基づくタンパク質；又はリポカリン若しくはフィブロネクチンドメイン又はヒトγクリスタリン若しくはヒトユビキチンのいずれかに基づくアフィリンスカフォールドに基づくタンパク質のいずれかである、請求項９８又は９９に記載の結合パートナー。
請求項101
前記結合パートナーが抗体である、請求項１００に記載の結合パートナー。
請求項102
前記結合パートナーに対する前記ＧＰＣＲ変異体の結合親和性が、前記結合パートナーに対する前記親ＧＰＣＲの結合親和性と実質的に同一であるか又はそれよりも大きい、請求項９８から１０１のいずれか一項に記載の結合パートナー。
請求項103
親ＧＰＣＲのＧＰＣＲ変異体を含むバイオセンサーであって、前記ＧＰＣＲ変異体が親ＧＰＣＲと比較して特定の立体構造で増大した安定性を有し、且つ、標的物質が前記ＧＰＣＲ変異体に結合した際に検出可能なシグナルが生成される、バイオセンサー。
請求項104
前記ＧＰＣＲ変異体が、請求項４５から８２のいずれか一項で規定されるように提供される、請求項１０３に記載のバイオセンサー。
請求項105
前記ＧＰＣＲ変異体が、請求項８３から９６のいずれか一項で規定されるものである、請求項１０３又は１０４に記載のバイオセンサー。
請求項106
前記検出可能なシグナルが、色の変化；蛍光；エバネッセンス；表面プラズモン共鳴；電気伝導度若しくは電荷分離；紫外、可視若しくは赤外吸収；発光；化学発光；電気化学発光；蛍光異方性；蛍光強度；蛍光寿命；蛍光偏光；蛍光エネルギー移動；分子量；電子スピン共鳴；核磁気共鳴；流体力学的容積若しくは半径；比重；シンチレーション；電界効果抵抗；電気インピーダンス；音響インピーダンス；量子消失；共鳴散乱；蛍光クエンチング；蛍光相関分光法；音響負荷；音響せん断波速度；結合力；又は界面応力のいずれかである、請求項１０３から１０５のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
請求項107
前記バイオセンサーが、水晶膜厚計バイオセンサー、エバネッセント波バイオセンサー、プレーナー導波路バイオセンサー、表面ラマンセンサー、又は表面プラズモン共鳴バイオセンサーなどのフローベースのバイオセンサーである、請求項１０３から１０６のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
請求項108
前記標的物質が、分子、生体分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ＧＰＣＲリガンド、合成分子、薬剤、薬剤代謝産物又は疾患バイオマーカーのいずれかである、請求項１０３から１０７のいずれか一項に記載のバイオセンサー。